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试验旨在研究没食子酸(gallic acid,GA)对黄牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响,进一步优化黄牛卵母细胞体外成熟体系。在卵母细胞体外成熟液(M液)中添加不同浓度没食子酸(0、10、30、50、100μmol/L),成熟22~24h后,统计卵丘扩展情况及卵母细胞成熟率;同时,对成熟的卵母细胞进行正常体外受精(IVF),统计早期胚胎的分裂率、囊胚率、囊胚卵裂球数及卵裂球细胞凋亡率。根据试验结果,选择最优浓度,使卵母细胞在含该浓度没食子酸的成熟液中成熟24h后,检测其细胞内的活性氧水平(ROS)和总谷胱甘肽(TGSH)含量。结果显示,M液中添加30μmol/L没食子酸组卵丘扩展分值和成熟率显著高于对照组(0μmol/L)(P0.05),其他处理组与对照组无显著差异(P0.05);成熟的卵母细胞体外受精后进行后续胚胎培养,其中10和30μmol/L组的分裂率均显著高于对照组和100μmol/L组(P0.05),50和100μmol/L组分裂率较对照组也有所提高,但差异不显著(P0.05);早期囊胚率统计发现,与对照组相比,30和100μmol/L能够显著提高囊胚发育率(P0.05),10和50μmol/L浓度组则无显著差异(P0.05);与对照组相比,30、100μmol/L没食子酸均能显著提高IVF胚胎的早期囊胚卵裂球数(P0.05);但囊胚卵裂球凋亡率与对照组无显著差异(P0.05);对卵母细胞内活性氧和总谷胱甘肽含量检测时,发现30μmol/L没食子酸可显著降低细胞内活性氧水平(P0.05),且显著提高总谷胱甘肽含量(P0.05)。综上所述,在黄牛卵母细胞体外成熟液中添加适量的没食子酸能有效降低卵母细胞内活性氧水平,提高总谷胱甘肽含量,进而提高卵母细胞成熟的质量及其后续IVF胚胎发育能力。 相似文献
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为了研究蛋白酶体抑制剂三肽基乙醛(MG132)对水牛卵母细胞体外成熟及体外受精(IVF)胚胎发育的影响,试验采用不同浓度(0,1,2.5,5μmol/L)MG132成熟液培养水牛卵母细胞24 h并统计第一极体排出率;然后对各组卵母细胞进行IVF,统计胚胎的发育率;最后采用免疫荧光技术检测组蛋白甲基化修饰(H3K4me3、H3K9me2和H3K9me3)的表达情况。结果表明:卵母细胞经不同浓度MG132处理后,其第一极体的排出率以及后续IVF胚胎的分裂率、8-细胞率差异不显著(P0.05)。但1μmol/L MG132提高了IVF胚胎的桑椹胚率和囊胚率(P0.05);而5μmol/L MG132对胚胎的桑椹胚率和囊胚率无显著促进作用(P0.05)。1,5μmol/L MG132分别提高胚胎的H3K4me3、H3K9me2的表达(P0.05),但各组H3K9me3的表达无显著差异(P0.05)。说明1μmol/L MG132通过提高胚胎H3K4me3的表达从而促进IVF胚胎的发育。 相似文献
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试验旨在研究没食子酸（gallic acid，GA）对黄牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响，进一步优化黄牛卵母细胞体外成熟体系。在卵母细胞体外成熟液（M液）中添加不同浓度没食子酸（0、10、30、50、100 μmol/L），成熟22~24 h后，统计卵丘扩展情况及卵母细胞成熟率；同时，对成熟的卵母细胞进行正常体外受精（IVF），统计早期胚胎的分裂率、囊胚率、囊胚卵裂球数及卵裂球细胞凋亡率。根据试验结果，选择最优浓度，使卵母细胞在含该浓度没食子酸的成熟液中成熟24 h后，检测其细胞内的活性氧水平（ROS）和总谷胱甘肽（TGSH）含量。结果显示，M液中添加30 μmol/L没食子酸组卵丘扩展分值和成熟率显著高于对照组（0 μmol/L）（P<0.05），其他处理组与对照组无显著差异（P>0.05）；成熟的卵母细胞体外受精后进行后续胚胎培养，其中10和30 μmol/L组的分裂率均显著高于对照组和100 μmol/L组（P<0.05），50和100 μmol/L组分裂率较对照组也有所提高，但差异不显著（P>0.05）；早期囊胚率统计发现，与对照组相比，30和100 μmol/L能够显著提高囊胚发育率（P<0.05），10和50 μmol/L浓度组则无显著差异（P>0.05）；与对照组相比，30、100 μmol/L没食子酸均能显著提高IVF胚胎的早期囊胚卵裂球数（P<0.05）；但囊胚卵裂球凋亡率与对照组无显著差异（P>0.05）；对卵母细胞内活性氧和总谷胱甘肽含量检测时，发现30 μmol/L没食子酸可显著降低细胞内活性氧水平（P<0.05），且显著提高总谷胱甘肽含量（P<0.05）。综上所述，在黄牛卵母细胞体外成熟液中添加适量的没食子酸能有效降低卵母细胞内活性氧水平，提高总谷胱甘肽含量，进而提高卵母细胞成熟的质量及其后续IVF胚胎发育能力。 相似文献
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旨在研究外源性褪黑素(melatonin,MT)对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其受体介导机制。进行以下试验:1)通过免疫荧光技术检测了水牛卵丘细胞和卵母细胞上褪黑素的两种受体MT1和MT2的表达情况。2)在体外成熟培养液中添加不同浓度褪黑素(0、10-9、10-8、10^(-7 )mol·L-1),观察褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟及其随后体外受精胚胎发育的影响。3)根据褪黑素最优浓度,成熟液中添加不同处理组合:未处理组、褪黑素(10^(-8 )mol·L^(-1 )MT)、褪黑素受体拮抗剂(10^(-8 )mol·L^(-1 )LZU)、褪黑素受体激动剂(10^(-8 )mol·L^(-1 )IIK7)、同时添加褪黑素受体拮抗剂和褪黑素(10^(-8 )mol·L^(-1 )LZU+10^(-8 )mol·L^(-1 )MT),处理卵母细胞24h后,统计卵母细胞第一极体排出率,并对第一极体的卵母细胞进行ELISA Kit检测,同时,成熟后的卵母细胞分别进行体外受精,并统计其分裂率和囊胚率。结果显示:1)在水牛卵丘细胞和卵母细胞上均发现有褪黑素受体MT1和MT2;2)褪黑素处理的各组卵母细胞成熟率均显著高于0 mol·L-1组(P<0.05)。随后,各组受精后的分裂率也显著高于0mol·L^(-1 )MT组(P<0.05),而且10-8和10^(-7 )mol·L^(-1 )MT组的囊胚率显著高于0mol·L^(-1 )MT组(P<0.05);3)褪黑素受体拮抗剂(10^(-8 )mol·L^(-1 )LZU)组的卵母细胞成熟率、体外受精胚胎分裂率和囊胚率与未添加组相比,差异均不显著(P>0.05);褪黑素受体激动剂(10^(-8 )mol·L^(-1 )IIK7)组的水牛卵母细胞成熟率、体外受精胚胎分裂率和囊胚率均显著高于未添加组(P<0.05),但与褪黑素组(10^(-8 )mol·L^(-1 )MT)相比差异不显著(P>0.05);同时添加褪黑素受体拮抗剂和褪黑素(10^(-8 )mol·L^(-1 )LZU+10^(-8 )mol·L^(-1 )MT)组的水牛卵母细胞成熟率、体外受精后胚胎的分裂率和囊胚率与未添加组相比,差异不显著(P>0.05)。4)褪黑素处理组的卵母细胞内cAMP的含量显著低于未处理组,而cGMP含量显著高于未处理组(P<0.05)。综上表明,褪黑素通过与细胞膜G蛋白偶联受体MT1和MT2结合,从而抑制了cAMP合成,提高cGMP含量,进而促进卵母细胞成熟及早期胚胎发育。 相似文献
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本研究旨在对水牛anti-silence factor 1a (asf1a)基因进行克隆并行生物信息学分析,并进一步筛选基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的高效敲除asf1a基因位点。根据NCBI公布的牛asf1a基因mRNA序列设计特异性引物,以水牛GV期卵母细胞RNA反转录后的cDNA作为模板,通过PCR技术克隆获得asf1a基因序列片段,利用生物信息学分析方法,对克隆得到的序列进行和相应翻译的蛋白质进行了分析。在克隆得到的水牛asf1a基因序列上筛选3个PAM位点,并根据PAM位点构建3个gRNA载体(g1、g2、g3)以及相应的RGS载体,将pcDNA3.1-h Cas9连同gRNA、RGS 3种质粒按照3∶1∶1比例共转293T细胞,筛选高效的CRISPR/Cas9敲除位点。试验以水牛GV期的卵母细胞RNA作为模板,通过RT-PCR技术克隆获得asf1a基因序列,并据测序结果设计靶向区域筛选高效asf1a基因敲除位点。结果发现,水牛asf1a基因CDS区全长615 bp,编码204个氨基酸;多重序列分析显示,水牛asf1a基因核苷酸序列与黄牛、绵羊、猪、人、小鼠同源性分别达到了99%,98%,97%,96%,93%;蛋白质结构预测分析发现存在ASF1-hist-chap等结构,二级结构含有9个α螺旋、12个β折叠、14个T转角、14个无规则卷曲。系统进化树分析表明,水牛和黄牛亲缘性最接近。根据水牛asf1a设计的敲除载体转染293T和成纤维细胞后,细胞基因组进行T7E1酶切的结果表明,g1位点对水牛成纤维细胞敲除效率最高,达到93.82%,同时,sanger测序表明效率达17/20。本研究成功克隆了水牛asf1a基因和分析了其生物学信息,同时筛选出了asf1a的高效敲除位点,为研究水牛asf1a基因功能奠定基础。 相似文献
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