微小隐孢子虫三个基因主要抗原表位区的串联表达及其抗原性分析     

秦培兰  李艳  米荣升  呼高伟  黄燕  周鹏  张国恩  苏庆美  曹薇 《中国动物传染病学报》2012,20(3):36-43

应用多个抗原袁位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的氨基酸序列进行T细胞袁位预测及分析,从中选取了三个抗原表位富集的基因片段,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)将该三个基因片段串联在一起,各基因片段之间以柔性氨基酸(GGGGS)碱基序列链接,得到的拼接片段命名为CpTm.将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pET-CpTm,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.结果成功地构建了CpTm串联基因并在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,质谱分析表明重组表达蛋白包含了上述三个抗原的氨基酸序列.Western blot分析显示该重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清及隐孢子虫鼠基因型CP15、P23、CP15/60基因重组表达蛋白免疫兔血清识别,制备的抗血清能被重组蛋白特异性识别,表明表达的重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为多表位疫苗的研制奠定了基础.  相似文献   

微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60基因的融合表达及抗血清的制备     

秦培兰  米荣升  黄燕  周鹏  张国恩  苏庆美  呼高伟  曹薇  陈兆国 《动物医学进展》2012,33(7):54-59

以微小隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得子孢子表面抗原CP15、P23和CP15/60基因。利用重叠延伸PCR(SOE PCR)将该3段基因片段串联在一起,各基因片段之间引入柔性氨基酸接头(GGGGS)编码基因。将串联基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达载体,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果表明,获得了CP15-P23-CP15/60融合基因,并在大肠埃希菌中高效表达,Western blot显示重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清识别,制备的多克隆抗体能被重组蛋白特异性识别,表明获得的重组蛋白具有较好的抗原性。  相似文献   

微小隐孢子虫miR-2980真核表达载体的构建及初步鉴定     

呼高伟  程天印  米荣升  秦培兰  黄燕  周鹏  曹薇  陈兆国 《安徽农业科学》2012,(13):7739-7741,7803

[目的]构建微小隐孢子虫的miR-2980真核表达载体,并进行鉴定。[方法]从微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)基因组DNA扩增cp-miR-2980前体,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pVAXⅠ载体上,转染HCT-8细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR检测cp-miR-2980的表达。[结果]成功构建了cp-miR-2980真核表达载体pVAX-miR2980,RT-PCR检测证实其能在真核细胞HCT-8中表达。[结论]构建的真核表达载体pVAX-miR2980能在HCT-8细胞中成功表达cp-miR-2980,为后续研究cp-miR-2980的功能奠定了基础。  相似文献   

微小隐孢子虫miR-2980真核表达载体的构建及初步鉴定(英文)     

呼高伟  程天印  米荣升  秦培兰  黄燕  周鹏  曹薇  陈兆国 《农业科学与技术》2012,(5):1093-1096

[目的]构建微小隐孢子虫miR-2980真核表达载体,并进行鉴定。[方法]从微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)基因组DNA扩增cp-miR-2980前体,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pVAX1载体上,转染HCT-8细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR检测cp-miR-2980的表达。[结果]成功地构建了cp-miR-2980真核表达载体pVAX-miR2980,RT-PCR检测证实其能在真核细胞HCT-8中表达。[结论]构建的真核表达载体pVAX-miR2980能在HCT-8细胞中成功表达cp-miR-2980,为后续研究cp-miR-2980的功能打下了基础。  相似文献   

不同DNA提取方法对隐孢子虫卵囊PCR检测的影响     

陈兆国  米荣升  周鹏  黄燕  张国恩  苏庆美  秦培兰  呼高伟  林矫矫 《中国兽医寄生虫病》2011,19(1):57-61

为了提高隐孢子虫PCR检测的敏感性和效率,采用10种基因组DNA提取方法,对隐孢子虫卵囊DNA进行提取,对提取的DNA进行nested PCR扩增。经过3次重复试验,结果显示,Chelex 100法、FTA试纸法和Wizard DNAClean-Up System试剂盒法敏感性最高,能够稳定地扩增出1×10^2个卵囊提取的DNA,适合隐孢子虫病分子流行病学调查时大量样品DNA的提取。  相似文献   

隐孢子虫P23基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立     

张国恩  米荣升  苏庆美  黄燕  周鹏  胡义彬  秦培兰  呼高伟  陈兆国 《中国兽医寄生虫病》2011,19(2):43-50

将隐孢子虫鼠基因型（Cryptosporidium mouse genotype）P23基因亚克隆到pGEX-4T-1载体中,并用大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌诱导表达。以纯化的rP23为诊断抗原,建立隐孢子虫间接ELISA检测方法,观察其敏感性、特异性和重复性,并对临床血清样品进行检测。结果隐孢子虫鼠基因型P23基因在大肠杆菌中获得了高效表达,Western blot检测显示rP23能被隐孢子虫感染兔血清识别。以纯化rP23为诊断抗原,成功地建立了检测兔隐孢子虫病的间接ELISA技术。对23份临床血清检测结果显示,该方法检出率高于Sheather＇s蔗糖漂浮法、套式PCR法。本研究结果为研制兔隐孢子虫病诊断试剂盒打下了基础。  相似文献   

猪附红细胞体MSG1基因的克隆及序列分析     

曹薇  周鹏  米荣升  黄燕  秦培兰  杨晓娇  王向佩  王晓娟  石凯 《动物医学进展》2013,34(7)

为研究猪附红细胞体MSG1基因的遗传变异特点,从上海地区3个屠宰场采集自然感染附红细胞体的猪血液,提取基因组DNA,根据GenBank已经发表的猪附红细胞体MSG1基因序列(登录号AM407404.1),设计引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析.结果共获得了82条猪附红细胞体MSG1基因序列,序列长度为1 011 bp,共编码336个氨基酸.同源性分析显示与GenBank中已经发表的猪附红细胞体MSG1基因核苷酸序列相似性为96.5％～98.3％,氨基酸的相似性为97.9％～99.1％0.MSG1基因核苷酸序列的系统进化分析表明,上海地区猪附红细胞体分离株与GenBank登录的德国54/96分离株序列的亲缘关系较远.  相似文献