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本研究在马传染性贫血病毒（EIAV）基因转移载体pcPPTPRE（＋）的基础上[含有报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）和人乙型肝炎病毒转录后调控元件（HARE）1,对其转录后调控元件和外源基因启动子进行优化。参考土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepatitis virus,WHV）基因组序列和人巨细胞病毒增强子／鸡B—actin启动子序列（CAGp）,设计合成2对引物,分别扩增WHV转录后调控元件（WARE）和CAGp片段,正向插入pcPPTPRE（＋）获得重组质粒pcPPTWARE和pcPPTWCAG。将获得的EIAV转移载体pcPPTWARE和pcPPTWCAG以及pcPPTPRE（＋）,脂质体法分别转染人胚肾细胞HEK293和鸡胚成纤维细胞系DF-1,转染后12h、24h、36h、48h在荧光显微镜下观察特异性绿色荧光的表达。48h后收获细胞,利用流式细胞仪检测转染细胞中表达EGFP的阳性细胞。结果表明,在HEK293细胞中pcPPTWARE和pcPPTWCAG的阳性细胞平均百分率均极显著高于pcPPTPRE（＋）（P〈0．01）,pcPPTWCAG显著高于pcPPTWARE（P〈0．05）;pcPPTWCAG的平均道数值极显著高于pcPPTPRE（＋）和pcPPTWARE,pcPPTWPRE显著高于pcPPTPRE（＋）。在DF-1细胞中pcPPTWARE和pcPPTWCAG的阳性细胞平均百分率均显著高于pcPPTPRE（＋）,而pcPPTWARE和pcPPTWCAG的平均道数值均极显著高于pcPPTPRE（＋）,pcPPTWCAG显著高于pcPPTWARE。本研究利用WARE和CAGp优化构建了EIAV基因转移载体pcPPTWCAG,获得了较强的基因表达能力,为以鸡为宿主进行转基因研究提供了条件。 相似文献
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在马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体成功构建并优化的基础上,构建了EIAV基因转移载体包装盒表达重组质粒.分别根据EIAV驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆(pLGFD3-8)和驴白细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆pOK8266T序列,设计并合成引物,扩增EIAV gag/pol全基因和rev基因的第2个外显子,分别插入真核表达载体pCDNA3.1(+),获得表达载体pCDFGP和pCDREV,与亲本株的核苷酸同源性分别是99.6%和99.8%, 编码蛋白Gag、Pol及Rcv蛋白的推测氨基酸同源性分别为99.2%、98.3%和100%.利用脂质体法,分别将pCDFGP和pCDREV单独及共转染HEK293细胞,利用EIAV阳性血清分另7进行间接免疫荧光抗体试验OVA)和蛋白免疫印迹试验(western blot),检测外源蛋白的表达情况.结果表明,双质粒共转染的细胞中转染后48 h可检测到特异性荧光,转染后60 h的细胞裂解产物中可以检测到55 ku的Gag蛋白及26 ku的p26蛋白,而单独转染pCDFGP和pCDREV的细胞,IFA和western blot试验结果均为阴性.结果表明同时存在gag/pot和rev 基因第4外显子的情况下,EIAV包装盒才能表达. 相似文献
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