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绵羊卵巢oar-mir-150靶向调节类固醇激素合成急性调节蛋白基因的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为研究吐鲁番黑羊(Ovis aries)的繁殖调控,培育新的高繁殖力绵羊品种,本研究以吐鲁番黑羊卵泡期和黄体期显著差异表达的绵羊微小RNA150(Ovis aries microRNA150,oar-mir-150)为研究对象,利用生物信息学预测oar-mir-150的靶基因,应用qRT-PCR检测吐鲁番黑羊卵泡期和黄体期卵巢组织中oarmir-150和类固醇激素合成急性调节蛋白基因(steroidogenic acute regulatory protein gene,STAR)的表达水平,合成野生型、突变型和缺失型STAR基因碱基序列,退火扩增后与PGL3-control载体连接,构建荧光素酶报告基因重组载体,将绵羊oar-mir-150 mimic或negative control mimic与重组载体共转到293T细胞,利用双荧光素酶活性检测实验检测荧光素酶活性。结果表明,oar-mir-150的全部靶基因有540个,其中卵泡期与黄体期差异表达的靶基因有8个,STAR基因作为卵泡期较黄体期表达显著上调的靶基因其mRNA的3'非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)存在oar-mir-150靶标结合位点(UUGGGAG);相对定量结果显示:卵泡期与黄体期相比,吐鲁番黑羊卵巢组织中oar-mir-150相对表达量为0.73,显著下调(P0.05),STAR mRNA相对表达量为1.90,显著上调(P0.05);成功构建野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组载体,并以最佳转染效率和最佳转染比例进行转染;双荧光素酶活性检测结果表明oar-mir-150靶向负调控STAR的表达。研究证明了oar-mir-150与STAR间存在确切的靶向关系,且负调控STAR基因的表达,为研究微小RNA(microRNA,mi RNA)在发情周期的不同阶段调控吐鲁番黑羊繁殖过程提供理论依据。 相似文献
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【目的】分析山羊PRNP基因启动子活性区域,旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子,为阐明山羊PRNP基因的表达调控提供理论依据,并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路。【方法】以山羊PRNP基因序列（GenBank登录号：EU870890）为模板,设计特异性引物,扩增山羊PRNP基因5′侧翼区片段,并将扩增片段克隆至pEASY-T3载体,鉴定为阳性的克隆进行测序;利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区域和转录因子结合位点的预测;利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段11个,并克隆至pEASY-T3载体后,鉴定为阳性的质粒和pGL3-Basic载体分别用限制性内切酶Mlu I和Bgl II进行酶切,并回收酶切产物;利用T4连接酶进行目的片段与pGL3-Basic连接,鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序,并提取无内毒素质粒,用脂质体转染法瞬时转染至SH-SY5Y细胞,转染48h后,利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变重组质粒在细胞内的启动活性检测。【结果】成功克隆了山羊PRNP基因5′侧翼区片段,长度为2 332 bp,且该片段含有预测的启动子活性区域、保守的motifs和多个转录因子的结合位点;成功克隆了11个含有不同长度启动子的片段,并与荧光素酶报告基因连接,并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒;转染时脂质体与DNA的比例为1﹕0.5,萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50﹕1;山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子,启动子活性最强的区域为-519-+82 bp,且在-220-+59 bp这一区域存在着正调控元件,外显子1对启动子活性中起重要的调控作用;4个motifs可能为正调控元件结合位点;在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点,2个AP-2 alpha结合位点和1个AP-1结合位点;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分别预测为转录因子Foxp3和COE 1的结合位点。【结论】确定了山羊PRNP基因启动子的核心区域（-519-+82bp）,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。 相似文献
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以常规饲养肉仔鸡作为试验动物,对照组采用麻醉后开胸电刺激诱发室颤测定室颤阈,试验组采用麻醉后注入心律平5min左右再开胸电刺激诱发室颤测定室颤阈。根据对照组和试验组室颤阈值的差异显著性比较,分析心律平对肉仔鸡室颤阈的影响。结果试验组的室颤阈值为(14.64±2.8)V,而对照组的室颤阈为(6.20±1.2)V,两者差异极显著(P<0.01)。此结果显示心律平可明显提高肉仔鸡室颤阈和大幅度降低肉仔鸡的心肌易颤性。由此推测:心律平有希望在肉鸡猝死综合征的预防中发挥作用。 相似文献
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为研究微小RNA(micro RNA,miRNA)调控吐鲁番黑羊(Ovis aries)发情周期的机制,培育高繁殖力绵羊品种,本研究利用活体手术法分别采集3只吐鲁番黑羊卵泡期和黄体期的一侧卵巢,采用高通量测序获取miRNA数据并进行生物信息学分析,构建和分析吐鲁番黑羊卵巢miRNA在卵泡期和黄体期的表达谱及其差异表达,筛选两时期差异表达miRNA的靶基因进行基因功能注释(Gene Ontology,GO)和通路富集分析(Kyoto Encyclopedia Of Genes and Genomes,KEGG),利用qRT-PCR随机选择3个差异表达的miRNA进行表达水平的验证。获得了吐鲁番黑羊黄体期和卵泡期卵巢表达的已知miRNA 139个,其中126个在两个时期共表达,3个在黄体期特异表达,10个在卵泡期特异表达,并筛选出吐鲁番黑羊两个时期19个差异表达miRNA;GO和KEGG分析结果表明吐鲁番黑羊两个时期差异表达miRNA靶基因分别在抗原处理和提呈、内质网中蛋白质的处理、蛋白酶体、溶酶体和利什曼病5个通路中达到显著富集;qRT-PCR结果显示,选择的3个差异表达miRNA表达水平与测序结果一致。研究获得了吐鲁番黑羊黄体期和卵泡期卵巢组织中miRNA的表达谱,并筛选出差异表达的miRNA及其预测靶基因所参与的信号通路,为该品种后续的卵巢miRNA的研究提供基础资料。结合GO和KEGG分析结果推测差异表达miRNA是通过靶基因参与免疫、蛋白质加工相关通路调节吐鲁番黑羊的繁殖活动。 相似文献
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