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【背景】前期研究发现,水稻病程相关蛋白质OsPR1A的表达受上游抗病基因Xa21调控,接菌后早期启动Xa21介导的OsPR1A较高水平表达对水稻抵抗白叶枯病菌至关重要。同时OsPR1A也受到水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo）的诱导表达。对于OsPR1A的研究绝大部分是作为抗性反应发生的标志基因佐证其他基因或途径在抗性中的作用,缺乏直接的证据证实OsPR1A本身的生物学功能。【目的】通过获得OsPR1a-OX超表达转基因植株,调查其表型及农艺性状,并明确OsPR1A蛋白质表达与抗性的关系,为鉴定OsPR1A功能提供依据。【方法】通过农杆菌介导法,将构建的OsPR1a-OX转化载体转入到水稻受体4021中,利用PCR和免疫印迹（western blot,WB）技术分别在基因水平和蛋白质水平上筛选并鉴定OsPR1A超表达阳性纯合株系。在成熟期,调查OsPR1A超表达转基因植株的表型及农艺性状（株高、穗长、分蘖数、结实率和籽粒大小等）。在31℃条件下,将生长2周的水稻幼苗TP309、4021和OsPR1A超表达转基因植株接种水稻白叶枯病菌,并在接菌0、2、4、6、8、10和12 d时测量病斑长度。在接菌0、4和6 d时,收集TP309、4021和OsPR1A超表达转基因植株的水稻叶片,提取蛋白质,利用WB技术检测OsPR1A的表达特征。【结果】构建了OsPR1a-OX转化载体,并转入到受体4021中,筛选并鉴定到2个OsPR1A超表达转基因纯合株系（#704和#709）。调查了OsPR1A超表达转基因植株在成熟期的表型及农艺性状,与对照4021相比,#704和#709的株高较矮、穗长较短、分蘖数减少、结实率降低,但籽粒稍大,可能与结实率低有关。在31℃条件下,OsPR1A超表达转基因植株的病斑长度与对照4021相比明显缩短,结果具有显著性差异（P<0.05）。在接菌0、4和6 d的材料中,超表达转基因植株#704和#709中OsPR1A始终有较高水平的表达丰度,从而提高了对白叶枯病菌的抗性。【结论】采用农杆菌介导法,获得OsPR1A超表达转基因植株;超表达OsPR1A影响到水稻的正常发育过程;超表达OsPR1A后增强了Xa21介导的水稻对白叶枯病的抗性。 相似文献
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转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的检测及其表达特征研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的免疫学检测方法,并了解其在水稻生长过程中的表达特征,本研究在大肠杆菌中表达了CP4-EPSPS蛋白质,纯化后以其为免疫原免疫小鼠,经筛选获得了可识别CP4-EPSPS的单克隆抗体。建立了用免疫印记技术检测转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的方法,该方法可以从单粒稻米的0.63%材料中检测到CP4-EPSPS信号。对水稻不同发育时期代表性组织的检测结果表明,CP4-EPSPS蛋白质呈组成型表达,在花药、穗轴、颖壳及不同时期的叶片中的表达量较高,但在分蘖期基部茎节、叶鞘及成熟期种子胚中的表达量稍低。本研究建立的免疫学方法在转基因水稻检测中具有潜在的应用价值。 相似文献
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水稻线粒体基因编码蛋白质在种子萌发及叶片发育过程中的表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
线粒体是真核生物中主要的能量供应细胞器,虽然多种植物的线粒体基因组序列已知,但对线粒体基因编码蛋白质的表达研究关注甚少。本研究采取基于抗体的蛋白质组学策略,制备了17个线粒体基因编码蛋白质的特异性抗体,包括NADH脱氢酶、细胞色素C氧化酶、细胞色素C合成酶、ATP合酶和核糖体蛋白质等5类,利用免疫印迹技术(Western blot)调查了这些蛋白质在水稻种子萌发及不同生长发育时期叶片中的表达情况。结果发现,在种子萌发阶段,ATP合酶中的亚基9和核糖体蛋白质S13亚基表达上调,细胞色素C合成酶CCMB和CCMC表达下调,其余13个表达没有发生变化。在叶片发育阶段,15个蛋白质发生表达上调,且表达模式基本相似,均呈现前期较低,随发育逐渐提高,到成株期达到峰值,其中部分蛋白质在成熟期仍维持在较高的峰值强度(如NAD4、CCMFc、ATP9、RPS1、RPS4和RPS7),提示这些蛋白质在成熟后的灌浆期仍发挥一定作用,而其余蛋白质在成熟期表达量明显下降,提示其功能主要是在营养生长阶段发挥。有意思的是,在叶片发育阶段,RPS19蛋白质表达下调,ATP1蛋白质的表达稳定,它们的特征和功能值得进一步关注。本试验结果直观且相对定量地揭示了线粒体基因编码蛋白质的表达与种子萌发和叶片生长之间的关联,为深入了解其功能提供了有价值的线索。 相似文献
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转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测 总被引：3，自引：1，他引：2
【目的】制备抗CAS9蛋白质的单克隆抗体,建立转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测方法,了解CAS9蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以带Cas9的质粒DNA为模板,PCR扩增Cas9 5′端810 bp片段后克隆到p ET30a载体中,将酶切验证且序列正确的重组质粒转入表达菌Condon Plus中,经IPTG诱导表达CAS9蛋白质(N端270氨基酸),用纯化的重组蛋白质作为免疫原免疫小鼠,制备单克隆抗体,用免疫印迹分析筛选特异性和灵敏度高的抗体细胞株。用特异性引物PCR扩增转基因水稻的Cas9,用免疫印迹检测转基因水稻中的CAS9蛋白质。将重组CAS9蛋白质和带有CAS9的水稻苗期叶片蛋白质进行平行免疫印迹分析,用Image J软件采集信号绘制CAS9蛋白质的标准曲线,进而对水稻叶片中的CAS9蛋白质进行定量分析。提取单粒稻米的总蛋白质,稀释后用免疫印迹分析CAS9蛋白质的检测下限,提取多个时期、部位的水稻材料的总蛋白质,包括苗期的地上部和地下部,分蘖期的茎、茎节、叶鞘、叶片等,用SDS-PAGE分离后免疫印迹检测比较CAS9蛋白质的表达特征。【结果】通过体外克隆、诱导表达获得了纯化的重组CAS9蛋白质N端片段,免疫小鼠后得到42株阳性杂交瘤细胞株,经筛选鉴定到#12D2细胞株对水稻样品的检测具有较好的特异性和灵敏度。用该抗体通过免疫印迹检测了转基因水稻,所建立的免疫印迹方法对重组CAS9蛋白质的检测下限约为0.25 ng。在水稻苗期叶片中,CAS9蛋白质约占鲜重的0.00005%,可检出单粒稻米8%样品(约2 mg)中的CAS9蛋白质。在苗期地上部CAS9蛋白质的表达丰度高于地下部,分蘖期茎和叶片中表达量较高,根和叶鞘表达量较低。【结论】获得特异性强、灵敏度高的抗CAS9单克隆抗体,建立了检测转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印记方法,揭示了CAS9蛋白质在水稻不同部位的表达特征,并展示了在其他植物中的应用潜力。 相似文献
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