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海七鳃鳗(Petromyzon marinus)是现存最古老的无颌类脊椎动物之一,对其重要免疫分子的研究在免疫系统的进化理论上有重要意义。细胞趋化因子CXCL8(又称白细胞介素-8,Interleukin 8)是最重要的趋化因子之一。为了研究海七鳃鳗CXCL8基因在天然免疫中的作用,以海七鳃鳗肝脏c DNA为模板,通过比对海七鳃鳗基因组信息设计引物,使用RT-PCR方法扩增得到PmCXCL8基因。随后构建原核表达载体pColdI-CXCL8,将载体转化至E.coli BL21和Rosetta(DE3)中进行表达,利用Bio-Rad IMAC蛋白质纯化试剂盒和Profinia蛋白质纯化系统进行纯化,纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,PmCXCL8开放阅读框(open reading frame,ORF)为309 bp,编码102个氨基酸,分子量为11.23 kDa,等电点为9.37。PmCXCL8氨基酸序列中保守的C36和C38之间插入一个氨基酸残基,为CXC型趋化因子,而且不含ELR(Glu-Leu-Arg)基序,相应位置被GGR(Gly-Gly-Arg)所替代。原核表达对比发现,该蛋白在E.coli Rosetta(DE3)中的表达优于E.coli BL21,最后通过亲和层析法纯化得到了高纯度的PmCXCL8重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定结果均得到单一的条带,分子量约为11.23 k Da,符合预期结果,表明已成功表达出可溶性良好的PmCXCL8重组蛋白。该研究为PmCXCL8功能的探究与抗体的制备提供了实验材料,也为七鳃鳗天然免疫系统进化的研究奠定了基础。 相似文献
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核转录因子NF-kB(Nuclear factor kappa B)对机体的免疫反应、炎症反应等起重要的调控作用。为了获得NF-kB基因启动子的活性报告基因,进一步研究原始脊椎动物免疫应答的机制,我们根据此前克隆得到的东北七鳃鳗(Lethenteron morii)NF-kB基因cds序列,以与东北七鳃鳗高度同源的日本七鳃鳗(Lampetra japonica)同源基因 5’上游启动子特征序列为模板设计引物,克隆获得了东北七鳃鳗NF-kB启动子序列,该序列全长3169 bp,提交至NCBI Genbank获得登录号MN368861。经AliBaba2.1软件预测该序列包含CREB (cgtgacttca)、Oct-1 (aatatgaatt)、GATA-1 (gaacctatct)、AP-1 (ggttgagtca)、NF-kappa B (ctttcctgtt)、IRF-1 (tttcctgttc)、Sp-1 (tgtgaggggt)、c-Jun (acgtgacttc)和c-Fos (ggttgagtca)等多个转录因子结合位点,并包含TATA box转录核心元件。通过MethPrimer软件预测在序列1207-1402 bp处存在CG含量大于50%,长196 bp的CpG岛。利用双酶切技术构建了pGL3-NF-kB-pro重组质粒,并将其转染至人胚肾细胞系（Human embryonal kidney, HEK293T）和鲤鱼上皮瘤细胞系（Epithelioma papulosum cyprinid, EPC）中。双荧光素酶报告基因系统检测结果显示该片段序列在哺乳动物细胞系和鱼类细胞系中均具有启动子活性,同时在HEK293T中经过Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）的配体LPS刺激后启动子活性显著上升。本研究成功构建了东北七鳃鳗NF-kB启动子报告基因,并在不同细胞系中证实了其活性。LPS刺激后的检测结果揭示东北七鳃鳗NF-kB参与了TLR信号通路的免疫应答。东北七鳃鳗NF-kB报告基因的构建为探究原始脊椎动物免疫系统信号传导机制奠定了基础。 相似文献
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