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旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)Nsp5基因进行原核表达,利用生物信息学软件,预测其编码蛋白的结构和功能,为了解PEDV致病机理奠定基础。本研究克隆PEDV/LY/2014/04毒株的Nsp5基因,亚克隆进pET-28a(+)原核表达载体,PCR和酶切验证重组质粒的构建,重组质粒pET-28a(+)-Nsp5转入E.coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE检测Nsp5的表达和His band Ni+纯化情况,Vector NTI Advance等软件对Nsp5蛋白氨基酸组成、抗原表位、二级和三级结构进行预测和分析。结果表明,成功克隆并构建了重组质粒pET-28a(+)-Nsp5,表达重组蛋白大小约22 ku,且主要以包涵体形式存在,His band Ni+纯化后获得高纯度重组蛋白。Nsp5蛋白是由196个氨基酸残基组成的多肽,其分子质量的理论值为21 820.07 u,理论等电点(pI)为8.734,略偏碱;二级结构骨架中α-螺旋(h)占55.61%,β-折叠(t)占7.65%,无规则卷曲(c)占20.92%,延伸链(e)占15.82%;Nsp5蛋白质的三级结构中,中间段以α-螺旋为主作为骨架,C端多个复杂二级结构构成该蛋白的酶活性中心;B细胞抗原表位的预测,表明有15个潜在的B细胞优势表位。本研究为猪流行性腹泻病毒Nsp5蛋白质的生物学功能相关研究提供数据支持。 相似文献
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子宫内膜炎是指子宫粘膜受到侵害而发生的炎症。它不仅影响母牛的正常生理功能,而且还会导致母牛长期不孕,甚至终生不孕,是提高受胎率的最大障碍。Barbu等报道,不孕牛中有70％患慢性或隐性子宫内膜炎。在国内,奶牛子宫内膜炎的发病率也很高,瞿自明等对16个城市41个奶牛场调查结果显示,奶牛子宫内膜炎发病率为17．26％,占不孕牛的68．34％。在金华,显性子宫内膜炎也占不孕牛的38．6％。 相似文献
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猪圆环病毒2型（PCV2）是一种引起仔猪Sus scrofa多系统衰竭综合征、免疫抑制、皮肤肾病综合征等疾病的病原体。根据GenBank中PCV2 ORF1基因序列设计合成特异性引物和探针,以PCV2基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的片段,并将目的片段克隆至pMD18-T载体,构建阳性标准品。以阳性标准品为模板,优化荧光定量PCR反应条件,建立标准曲线,进行灵敏性、重复性和特异性验证,并应用此方法对临床样品进行检测。结果表明:阳性质粒标准品构建成功,该检测方法的引物与探针的最佳浓度皆为0.2 μmol·L-1,线性检测范围为2.1×1013~2.1×106拷贝·L-1,最低检测限值为8.828×106拷贝·L-1,且与其他相关疾病无交叉反应;各批次检测变异系数低,检测方法稳定性好。本研究建立的敏感性高、特异性好的实时荧光定量PCR方法,为PCV2的快速检测提供了新工具。 相似文献
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<正> 在两年试验中,对15年生M11砧金冠苹果树,从开花起每隔1周喷布一次0.05％,0.075％和0.1％GA_(4+7),或0.7％可湿性硫磺+0.2％高岭土+0.05％Solubor(溶剂)混合物,共喷布5～7次。1984年,喷布0.1％GA_(4+7)的处理果锈最少, 相似文献
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为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。 相似文献
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