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根据GenBank上发表的PCV-1和PCV-2序列,设计2对引物分别扩增PCV-1和PCV-2的独特区域,长度为382 bp和222 bp.将PCR产物分别克隆至pMD-18T vector,经转化、PCR鉴定和序列测定,构建了PCV-1和PCV-2的阳性质粒,并等量混合作为二重PCR阳性模板.将2对PCR引物混合后,进行退火温度优化,敏感性和特异性试验,并用于临床检测.结果表明,该二重PCR方法可以特异性地鉴别PCV-1和PCV-2,最低检出量分别为0.1 ng和0.01 ng,敏感性较高.应用该方法可对临床样品进行准确、快速地诊断,为猪圆环病毒的临床诊断与流行病学调查等研究奠定了基础. 相似文献
2.
参考GenBank发表猪IL-15mRNA序列设计引物,用RT-PCR方法扩增猪IL-15cDNA,并克隆到pMD18-T载体中,通过PCR、酶切和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA-3.1（＋）上,得到重组质粒pcD-NA-pIL-15。在脂质体介导下,重组质粒pcDNA-pIL-15转染AD-293细胞。以鼠抗猪IL-15为一抗,用间接免疫荧光分析表明猪IL-15基因均在AD-293细胞中成功进行了瞬时表达。小鼠免疫试验表明,pcDNA-pIL-15作为免疫佐剂,能够有效提高小鼠的脾T细胞增殖,加强pcDNA-ORF2（PCV2）质粒免疫过程中的特异性中和抗体的产生,为进一步研制猪IL-15基因佐剂疫苗及进行临床实验奠定基础。 相似文献
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副猪嗜血杆菌环介导等温扩增检测方法的建立 总被引：3，自引：1，他引：2
本研究旨在建立检测副猪嗜血杆菌(Hps)的新方法。根据GenBank上发表的不同血清型Hps的16S rRNA序列,找出高度保守区域,再针对该区域设计了4条特异性引物,建立了Hps环介导等温扩增法(LAMP)。试验结果表明,LAMP方法在恒温(63℃)条件下特异性强,比PCR方法敏感100倍,鉴于目前副猪嗜血杆菌分离培养和鉴定的复杂性,LAMP操作简单、成本低,整个扩增反应在1 h内即可完成,为检测Hps提供了一个快速简便的分子生物学方法。 相似文献
4.
猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立 总被引：7，自引：4，他引：3
本研究设计了4条针对猪瘟病毒6个位点的特异性引物,建立了一种灵敏、特异、快速的猪瘟病毒体外等温扩增(RT-LAMP)检测方法,所建立的方法能够特异地检测出猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的存在,检测PRV、PRRSV、PCV-2等病毒均为阴性;灵敏度高,所建立的CSFV-RT-LAMP方法灵敏度为10-5,总RNA的检测阈值约为1pg;反应快速,整个扩增反应可在1h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察及电泳检测。本试验为猪瘟的现场快速检测提供更加简便、快速的方法,可以满足基层检疫的需要。 相似文献
5.
猪瘟病毒RT—LAMP实验诊断初报 总被引：1，自引：0，他引：1
为了探索猪瘟病毒诊断的新方法,本研究采用环介导等温扩增法（RT-LAMP）与RT—PCR方法分别对随即采样的80份猪瘟疑似病料进行猪瘟病毒实验室诊断及对比研究。结果表明RT-LAMP与RT—PCR检测得出的阳性率分别为38．75％和36．25％。RT—LAMP检测方法更加灵敏、特异、快速,可用来检测猪瘟病毒,在等温条件下进行,不需要复杂的仪器,操作简单,整个扩增反应可在1h内完成,为临床检测猪瘟病毒提供了一个快速简便的分子生物学方法。 相似文献
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