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为了提高甲型H1N1流感病毒HA基因DNA疫苗的免疫原性,本研究将流感病毒rPan09(HA和NA来自A/California/04/09,其余6个片段来自PR8的重组病毒)的HA基因通过人工合成的方法将其密码子优化为哺乳动物体内偏嗜性密码子opti-HA,同未优化的rPan09的HA基因分别与真核表达载体pCAGGS连接构成重组质粒pCA-optiHA和pCA-HA转染293T细胞,48 h后采用间接免疫荧光的方法检测HA基因的体外表达情况,结果显示重组质粒pCA-optiHA的蛋白表达量明显高于pCA-HA。为评价这两种重组质粒的免疫及保护效力,选取6~8周龄雌性BALB/c小鼠,将质粒pCA-HA、pCA-optiHA以100μg/只的剂量,进行后腿肌肉多点注射,同时设立空载体pCAGGS对照,共免疫3次,每次间隔2周。结果表明DNA疫苗pCA-optiHA可显著提高小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。三免2周后用107.45EID50的rPan09采用滴鼻方式进行攻毒,用Real-time PCR及制作肺组织石蜡切片检测DNA疫苗的保护效力。结果表明,pCA-optiHA免疫组的保护效力明显高于pCA-HA免疫组。本研究为进一步研究和设计有效的甲型流感病毒DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
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为制备一株猪流感灭活疫苗的候选毒株,本研究利用反向遗传学技术,将A/swine/Guangdong/1/11(H1N1)毒株的HA、NA基因和A/PR/8/34毒株的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因进行重组,成功拯救出鸡胚高度适应性毒株rH1N1。抗原性分析显示rH1N1保留了亲本毒株良好的抗原性。rH1N1接种10日龄鸡胚48 h后,血凝价达到210,表明该毒株能在鸡胚中高水平复制。该毒株为H1N1亚型猪流感灭活疫苗的研制奠定了坚实的物质基础。 相似文献
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本研究旨在优化组织培养法分离小鼠脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）,为研究成骨分化和成脂分化在间充质干细胞分化过程中的相互影响奠定基础。通过细胞形态学观察、细胞生长曲线和流式仪器检测所分离获得的间充质干细胞的特性,利用CRISPR-dCas9系统在快速促进间充质干细胞成骨分化的前提下观察其对成脂分化的影响,并通过生化染色、实时荧光定量PCR和免疫细胞学等手段进行分析。结果显示,接种3~5 d后可见细胞从组织块周围爬出,光镜下可见细胞形态多为成纤维细胞样的梭形细胞,且形态单一均匀,具有较高的爬出率,可以大大提高脂肪间充质干细胞的分离效率;通过CRISPR-dCas9系统激活Runx2和Osterix基因后可以促进间充质干细胞的成骨分化,实时荧光定量PCR及油红O染色结果显示,CRISPR-dCas9系统可以同时抑制间充质干细胞的成脂分化;通过CRISPR-dCas9-KRAB系统同时抑制成骨相关基因Runx2和Osterix后可以促进成脂分化。本研究利用组织贴壁法成功获得了高纯度的脂肪间充质干细胞,具有间充质干细胞的特性和分化能力;利用CRISPR系统可以同时过表达Runx2和Osterix两个基因,可以在进成骨分化的同时抑制成脂分化,表明成脂分化和成骨分化的相关性,为基因编辑在间充质干细胞诱导分化和临床应用方面提供了新的思路和方法。 相似文献
4.
M2蛋白是甲型流感病毒的跨膜蛋白,其优点为不易变异,且N端24个氨基酸组成的胞外区(M2e)十分保守,适合作为通用流感疫苗的靶标.因此本实验将4个拷贝的M2e通过赖氨酸与通用Th细胞表位偶联获得M2e分支肽(M2e-MAP),添加弗氏佐剂制备成合成肽疫苗免疫小鼠,评价其免疫原性及异源攻毒保护效力.ELISA实验结果表明,该疫苗能刺激机体产生高水平的抗M2e特异性IgG抗体；细胞因子IL-4的检测进一步说明了其能诱导产生高的体液免疫应答水平,ELISPOT实验从IL-4和IFN-γ两个方面分别说明了该疫苗不仅可以诱导高的体液免疫应答,而且能刺激机体产生高水平的细胞免疫应答.对免疫小鼠攻H9N2,通过肺病毒分离滴定和肺组织病理切片等方法检测攻毒保护效果,结果均表明,M2e分支肽疫苗能对异源病毒的攻击产生较好的保护效力.上述结果为流感通用疫苗的研究提供了一种参考思路. 相似文献
5.
利用RT-PCR技术扩增猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）的8个基因片段,分别克隆至双向转录表达载体PBD上,构建出8个能在哺乳细胞中复制和表达的质粒。将8个质粒共转染293T细胞,收取转染48 h时的细胞上清并接种9～11日龄SPF鸡胚,成功拯救出有血凝活性的病毒。经序列测定,确定拯救病毒的8个基因片段均来自猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）基因组。H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;同时,为H1N2亚型猪流感新型疫苗的研制开辟了新的途径。 相似文献
6.
本研究旨在为研制一种安全、有效并具有广泛保护作用的流感病毒通用疫苗进行初步的探索。从Gen-Bank上获得所有H1亚型经典猪源流感病毒和甲型流感病毒的HA基因序列,通过系统进化分析获得其共有序列,并对共有序列进行密码子优化(Optimized consensus,opti-CS),同时将H1亚型的A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和重组甲型流感病毒rPan09(H1N1,其HA和NA来自A/Swine/California/04/09,其余6个片段来自PR8的重组病毒)的HA基因分别进行密码子优化(opti-G11,opti-r09),并将这3种片段与真核表达载体pCAGGS连接获得重组质粒pCA-opti-CS、pCA-opti-G11和pCA-opti-r09。将重组质粒瞬时转染293T细胞,检测HA基因在哺乳动物细胞中的表达情况。免疫6～8周雌性BALB/c小鼠,免疫3次,每次间隔3周,同时设立空载体pCAGGS对照。三免2周后从每个质粒免疫组中选取一半小鼠每只以50μL 103.87 EID50的剂量接种A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)病毒,另一半小鼠每只以50μL 107.45 EID50的剂量接种rPan09病毒。采集血清,对HA抗体水平、HI滴度、细胞因子产生情况、肺组织病毒含量进行检测,并对肺组织病理学变化进行观察。结果显示:重组质粒中HA基因均能够在哺乳动物细胞中有效的表达。pCA-opti-CS免疫后能够诱导小鼠产生较高的HA抗体水平,较高的HI滴度,并且能够诱导机体产生较高水平的IL-4和IFN-γ。肺组织病毒含量测定以及组织病理学观察结果显示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS免疫后能够有效限制病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和rPan09HA在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。结果提示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,并具有较好的交叉保护效力,能够保护小鼠抵抗异源流感病毒的攻击。本研究为流感通用疫苗的研究提供了有益的参考。 相似文献
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DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量及表达抗原的免疫原性有直接关系。为了提高猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）HA基因DNA疫苗的表达量,增强其免疫效果,本研究通过人工合成的方法将H1亚型猪流感病毒A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）的HA基因密码子优化为猪体内偏嗜性密码子optiHA,同野生型A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）的HA基因分别与真核表达载体PCAGGS连接构成重组质粒PCAGGS—optiHA和PCAGGS—HA,然后分别转染293T细胞,48h后采用间接免疫荧光的方法检测Ⅲ基因的瞬时表达蛋白情况。将质粒PCAGGS—HA、PCAGGS—optiHA以100μg／只的剂量,采用后腿肌肉多点注射的方式,免疫6-8周龄雌性BALB／c小鼠,同时设立空载体PCAGGS对照。共免疫3次,每次间隔2周,三免2周后对每组以10^3.87 EID50的A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）进行攻毒。采用ELISA、血凝抑制试验、细胞因子检测和肺组织病毒含量测定等实验评价这两种DNA疫苗的免疫效果。结果表明,HA基因密码子优化的DNA疫苗可显著提高体液免疫和细胞免疫的应答水平,攻毒后免疫组PCAGGS—optiHA的保护效力明显高于免疫组PCAGGS—HA。这一结果为进一步研究和设计有效的SIVDNA疫苗奠定了基础。 相似文献
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本研究旨在优化组织培养法分离小鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs),为研究成骨分化和成脂分化在间充质干细胞分化过程中的相互影响奠定基础。通过细胞形态学观察、细胞生长曲线和流式仪器检测所分离获得的间充质干细胞的特性,利用CRISPR-dCas9系统在快速促进间充质干细胞成骨分化的前提下观察其对成脂分化的影响,并通过生化染色、实时荧光定量PCR和免疫细胞学等手段进行分析。结果显示,接种3～5 d后可见细胞从组织块周围爬出,光镜下可见细胞形态多为成纤维细胞样的梭形细胞,且形态单一均匀,具有较高的爬出率,可以大大提高脂肪间充质干细胞的分离效率;通过CRISPR-dCas9系统激活Runx2和Osterix基因后可以促进间充质干细胞的成骨分化,实时荧光定量PCR及油红O染色结果显示,CRISPR-dCas9系统可以同时抑制间充质干细胞的成脂分化;通过CRISPR-dCas9-KRAB系统同时抑制成骨相关基因Runx2和Osterix后可以促进成脂分化。本研究利用组织贴壁法成功获得了高纯度的脂肪间充质干细胞,具有间充质干细胞的特性和分化能力;利用CRISPR系统可以同时过表达Runx2和Osterix两个基因,可以在进成骨分化的同时抑制成脂分化,表明成脂分化和成骨分化的相关性,为基因编辑在间充质干细胞诱导分化和临床应用方面提供了新的思路和方法。 相似文献
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