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旨在制备禽致病性大肠杆菌(APEC)染色体编码外膜蛋白(cOmpT)的特异性单克隆抗体,本研究利用实验室已构建的APEC cOmpT重组表达质粒pET-28a-compT,经IPTG诱导表达后,获得以包涵体形式存在的约36 ku的重组蛋白cOmpT,利用尿素浓度梯度透析复性获得纯化蛋白cOmpT,并以此免疫BALB/c小鼠。建立间接ELISA检测方法,最适抗原包被浓度为0.625 μg·mL-1,最适血清稀释度为1:6 400。4次免疫后取小鼠脾进行细胞融合,采用有限稀释法多轮筛选后得到3株能稳定分泌针对cOmpT蛋白的单克隆抗体,分别命名为1G8、2C3和2G3,均为IgG2b亚类。3株杂交瘤细胞上清ELISA抗体效价分别为1:200、1:3 200和1:3 200。Western blot结果显示,3株单抗均能与cOmpT发生特异性反应,而不与其他受检菌发生交叉反应。运用原核表达系统对compT基因进行截短表达,对单克隆抗体针对的cOmpT抗原表位进行鉴定,结果显示单抗1G8、2C3和2G3识别的抗原表位分别是83DQDWMDS89、90SNPGTW95和197TFKYSGW203。本研究成功制备了3株抗cOmpT蛋白的单克隆抗体,并对其识别的抗原表位进行了鉴定,为cOmpT蛋白功能研究和APEC新型表位疫苗研发奠定了基础。 相似文献
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为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒,本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针,经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件,建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示该方法特异性强,对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为102、102、103、103 TCID50/mL,并具有良好的组内和组间重复性;而荧光定量PCR方法的检测下限分别为101、102、102、102<... 相似文献
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