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1.
为了解乳酸菌噬菌体的生物学特性,并为制定乳酸菌发酵生产过程中噬菌体污染的防控措施提供试验数据和参考,本研究通过斑点试验和双层琼脂平板法,以干酪乳杆菌（L. casei） ATCC 393、戊糖乳杆菌（L. pentosus） KLDS 1.0413、短小乳杆菌（L. brevis） ATCC 367为指示菌从乳制品、泡菜样品中分离乳酸菌噬菌体,通过透射电镜观察噬菌体形态,噬菌体基因组限制性内切酶作用分析其包装机制,并进行宿主范围和一步生长曲线的测定,SDS-PAGE分析噬菌体结构蛋白,对获得的噬菌体进行生物学特性鉴定。结果显示,分离获得3株烈性乳酸菌噬菌体,依次命名为Lc、Lpen和Lbre。电镜结果显示,噬菌体Lc、Lpen均由多面体头部和非收缩性尾部组成,而噬菌体Lbre由多面体头部和收缩性尾部组成。根据形态学分析,Lc和Lpen属于长尾噬菌体科（Siphoviridae）,B1类,Lbre属于肌尾噬菌体科（Myoviridae）,A1类。噬菌体基因组经限制性内切酶作用后,核酸电泳结果显示,噬菌体Lc、Lpen基因组均为异质平末端,其包装机制属满头包装,即pac-型,而Lbre含有黏性末端,其包装机制属于cos-型。宿主范围测定结果显示,噬菌体Lc、Lbre对宿主专一,而Lpen宿主谱较广。一步生长曲线显示,噬菌体Lc、Lpen和Lbre潜伏期分别为60、45和150 min,裂解期分别为45、90和105 min,裂解量分别为47、24和30 PFU/cell。SDS-PAGE分析显示,噬菌体Lc结构蛋白有7个,主要结构蛋白分子质量约为50 ku;噬菌体Lpen和Lbre结构蛋白均有5个,主要结构蛋白分子质量分别约为55和50 ku。综上,本研究分离获得3株乳酸菌烈性噬菌体,并对其主要生物学特性进行鉴定,对了解乳酸菌噬菌体及后续乳酸菌噬菌体污染的防治提供了试验数据和理论依据。 相似文献
2.
以纯化的猪传染性胃肠炎病毒重组M蛋白免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行融合、筛选,最终获得3株抗TGEVM蛋白的杂交瘤细胞系1B3、3C2、4A5,染色体平均记数为89对、92对、90对,间接ELISA检测1B3、3C2、4A5细胞培养上清的效价分别为1/4000、1/1000、1/4000,腹水效价分别为2×10~4、2×10~5、2×10~5。通过间接ELISA做病原检测,这3株单抗不与猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,而与传染性胃肠炎病毒显示良好的特异性。用制备的单抗通过间接免疫荧光做病原检测,发现染色后TGEV感染的细胞培养物在胞浆和细胞膜上出现黄绿色荧光,未接种病毒的细胞培养物未见有黄绿色闪亮荧光,结果表明,所制备的抗重组TGEVM蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为TGEV准确快速的病原诊断和TGEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。 相似文献
3.
为研究产气荚膜梭菌α、β、ε3种主要外毒素的免疫原性,构建基因亚单位多价疫苗,本研究通过PCR分别扩增α-β2及ε3种毒素基因,分别克隆于p Pro HTa载体中构建重组表达质粒p Pro-α-β2-ε,并转化大肠杆菌进行这3个目的基因的融合表达。SDS-PAGE分析显示,表达的α-β2-ε毒素融合蛋白大小约90 ku,主要以包涵体形式存在。将其免疫BALB/c小鼠后,分别利用A型和B型产气荚膜梭菌强毒素对免疫鼠进行攻毒,并测定免疫鼠血清中抗体对毒素的中和活性。结果表明,免疫鼠对A型和B型产气荚膜梭菌毒素1 LD100和2 LD100的攻毒保护率分别为100%和60%以及100%和80%。体外中和试验显示,免疫鼠血清稀释为1∶20时,对1 LD100A型和B型产气荚膜梭菌毒素的中和效率均可达到100%。以上结果表明,本研究制备的α-β2-ε融合蛋白具有良好的免疫原性,能够有效刺激机体产生中和抗体,可以作为基因工程疫苗的有效组分,为产气荚膜梭菌多价候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清抗体的间接ELISA方法,本研究以原核表达的重组N蛋白作为检测抗原,优化ELISA反应条件,建立了PEDV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对PEDV血清检测为阳性,对猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒感染猪的阳性血清检测结果均为阴性;其批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。采用建立的ELISA方法检测了130份临床样品,其中78份血清样品为PEDV抗体阳性。表明建立的以重组N蛋白为包被抗原检测PEDV血清抗体的方法可以用于检测PEDV感染及相关的流行病学调查。 相似文献
5.
为了研究M细胞靶向肽(Co1)和树突状细胞靶向肽(DC-targeting peptide,DCpep)的免疫增强作用,用实验室构建的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88ac-STa-LTB-STb-co1(KSLS-co1)的阳性质粒为模板,通过PCR的方法获得DCpep-KSLS-co1和KSLS-co1-DCpep融合基因。然后将DCpep-KSLS-co1、KSLS-co1-DCpep基因亚克隆到p PG612.1表达载体中,转化到干酪乳酸杆菌L.casei393。Western blot和间接免疫荧光分析显示,DCpep-KSLS-co1、KSLS-co1-DCpep基因在干酪乳酸杆菌中获得了表达。本试验为进一步研究M细胞靶向和树突状细胞靶向策略在乳酸菌活载体疫苗系统中应用提供物质基础。 相似文献
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为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。 相似文献
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根据乳酸乳球菌密码子的偏嗜性,优化设计并合成牛乳铁蛋白肽的两段基因序列LFcinB和LFampin,将其与乳酸乳球菌表达载体pAMJ399分别用SalⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接,并电转化至乳酸乳球菌MG1363中,经酶切鉴定表明获得带有两段牛乳铁蛋白肽基因的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363。结果表明,优化表达条件,在GM17培养基中添加3.8%的β-甘油磷酸二钠可以获得表达重组蛋白的适宜pH,West-ern-blot检测可见重组蛋白大小约13 ku,表明牛乳铁蛋白肽在重组乳酸乳球菌中获得了表达。 相似文献
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本试验以表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌（pNZ8112-PLFcin/Ef）饲喂断奶仔猪，研究其对仔猪生长性能的影响和抗产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）感染的效果。选取28日龄体重相近的健康断奶仔猪36头，随机分为3组（重组屎肠球菌组、空载体组和培养基组），每组3个重复，每个重复4头仔猪。重组屎肠球菌组和空载体组分别饲喂添加pNZ8112-PLFcin/Ef （6×1012 CFU/kg）和pNZ8112/Ef （6×1012 CFU/kg）的基础日粮，而培养基组饲喂含有相同体积的GM17液体培养基的基础日粮。试验期26 d。结果显示，与培养基组相比，重组屎肠球菌组断奶仔猪的平均日增重极显著提高（P<0.01）；料重比显著降低（P<0.05）；腹泻率明显降低，肠道菌群的均匀度和多样性指数均下降。为进一步探究表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌对断奶仔猪抵抗ETEC感染的保护作用，在连续饲喂21 d后，每个重复中随机挑选1头体况相近的断奶仔猪灌服ETEC。结果发现，与培养基组相比，攻菌后重组屎肠球菌组断奶仔猪血清白细胞介素-2（IL-2）、免疫球蛋白G （IgG）含量、肠黏液中分泌型免疫球蛋白A （sIgA）水平均显著升高（P<0.05）；脾脏指数显著提高（P<0.05），但胸腺指数、肠段长度及重量则均无显著差异（P>0.05）。综上所述，表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌能够起到促进断奶仔猪生长及抗ETEC感染的保护作用。 相似文献
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为探究表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11对雏鸡抵抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的作用,本研究利用IBDVCEF94株感染DF-1细胞,通过CCK-8法检测病毒感染后的细胞活性,利用qRT-PCR检测病毒载量,结果显示重组乳酸菌表达的牛乳铁蛋白肽可以抑制IBDV在DF-1细胞内的增殖;以重组乳酸菌pPG-XLFEC/M11饲喂雏鸡,利用IBDV强毒UK661株进行攻毒实验,结果显示饲喂重组菌的雏鸡相比于对照组,IBDV的感染对其组织器官的损伤较小,总免疫球蛋白IgG和SIgA含量增加,细胞因子IL-6、IL-8、TNF-琢和IFN-酌以及TLR2的mRNA转录水平均显著升高,且提高了雏鸡的存活率。本实验结果表明,重组鸡源乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽可以增强机体的免疫应答水平,对雏鸡具有一定的抗IBDV感染的作用。本研究为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用以及为禽类疾病的预防奠定基础。 相似文献
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【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性分泌型IgA抗体和在血液中检测到了IgG抗体的存在;体外细胞中和试验结果表明,血清抗体对猪轮状病毒的中和效价为1﹕40。【结论】表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答而且具有免疫中和效力。 相似文献