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本研究通过牛(Bos taurus)卵母细胞体外成熟培养不同时间(0和10 h),剥除卵母细胞外周的颗粒细胞后继续培养,观察其与不脱颗粒细胞正常体外成熟培养卵母细胞之间的差异.研究结果显示:成熟培养0脱颗粒细胞的卵母细胞,与正常成熟培养的卵母细胞在成熟率(19.51%vs.80.14%,P<0.05)、卵裂率(27.08%vs.82.61%,P<0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(7.69%vs.21.71%,P<0.05)差异显著;成熟培养10 h后脱颗粒细胞的牛卵母细胞,与正常体外成熟培养的卵母细胞相比,在成熟率(82.71%vs.80.14%,P>0.05)、卵裂率(83.01%vs.82.61%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(19.30%vs.21.71%,P>0.05)无显著差异.向成熟培养10h脱颗粒细胞的卵母细胞内注射pVenus-Hlfoo mRNA,pVenus,pDsRed1-N1和重组质粒pDsRedl-Hle都能够得到表达.非功能标记基因显微注射组与对照组在卵母细胞成熟率(81.42%vs.82.03%,P>0.05)、卵裂率(75.24%vs.78.15%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(17.42%vs.18.82%,P>0.05)上差异不显著.研究结果提示:在成熟培养10 h,剥离颗粒细胞不会影响牛卵母细胞的发育潜能,这一技术平台可以用于牛卵母细胞体外成熟分子机制的研究. 相似文献
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显微注射Ca^2＋激活小鼠M Ⅱ期卵母细胞 总被引：2，自引：0，他引：2
胞质内显微注入Ｃａ＾２＋可以激活小鼠Ｍ Ⅱ期卵母细胞，且随着卵龄的增加，激活率明显升高。卵龄小于１６ｈ（ｈＣＧ注射后）注射Ｃａ＾２＋引起的激活率很低，卵龄超过１８ｈ，激活率达到５０％以上。卵龄小于１６ｈ的卵母细胞，卵内注入超纯水未能激活卵母细胞，而在１８￣１９ｈ卵龄组，注射水的对照组激活率为３５％，但显著或极显著地低于注射Ｃａ＾２＋的试验组。激活前注射ＥＤＴＡ卵母细胞的激活率约为３０％，激活后注射 相似文献
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目的:建立可表达血清淀粉样P成分(SAP)转基因小鼠模型,以研究SAP基因的功能。方法:采用基因重组技术将SAP基因插入到pCMV-Tag5A真核表达载体上。经BciVI限制性内切酶酶切后,琼脂糖凝胶电泳回收2.7 kb目的片断,受精卵原核显微注射法将其注入雄原核,制备转基因小鼠。采用PCR法在基因水平筛选SAP转基因小鼠阳性小鼠;免疫沉淀法结合免疫印迹法在蛋白水平检测SAP基因在PCR阳性转基因小鼠中的表达情况。结果:成功构建了pCMV-Tag5A/mSAP真核表达载体。经显微注射法将2.7 kb线性目的基因片断注射入受精卵雄原核,移植入代孕母鼠,所生127只小鼠,其中PCR鉴定获得10只转基因阳性小鼠。免疫沉淀法和免疫印记法随机检测83#♂founder、7#♀founder与C57 BL/6J小鼠回交F1代PCR阳性转基因小鼠血清中外源SAP基因蛋白水平的表达,发现均有表达。结论:该研究以C57BL/6J小鼠为研究对象,成功地产生能稳定遗传SAP基因的过表达转基因小鼠模型,它将有利于研究SAP基因在炎症、淀粉样沉淀、自身免疫系统中的作用。 相似文献
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从转入鱼体的外源基因结构入手,逐步介绍了转基因鱼的构建过程,即从外源基因的构建到外源基因导入鱼体的过程,并重点介绍了目前所使用的几种将外源基因导入鱼体的方法。 相似文献
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猪脑内微量注射大豆黄酮对血浆LH水平的影响 总被引：5，自引：1，他引：4
在去势格丁根小公猪 (n =9)下丘脑MBH和VM部位注射大豆黄酮 (10 μl/头 ,8pg/ μl) ,注射后血浆LH浓度变化呈上升趋势 :在MBH部位 ,注射后 0 .5～ 2h有 4例 (4/ 5 )LH水平较注射前升高 ,1例 (1/ 5 )变化不明显 (P≤0 .0 5 ) ,注射 2 .5h后与注射前比较无明显变化 ;在VM部位 ,注射后 3例 (3/ 4 )升高 ,1例变化不明显。对照组除 1例外 ,其他在处理前后LH水平的变化不明显。结果说明 ,大豆黄酮可在下丘脑水平上增加去势公猪LH的分泌 相似文献
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利用CRISPR/Cas9系统高效敲除斑马鱼lncRNA基因启动子区 总被引：1，自引：0，他引：1
斑马鱼(Danio rerio)长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)基因Nondret002679与人(Homo sapiens)肿瘤相关基因间长非编码RNA682基因LNC-PHOX2B-2具有同源序列.本研究以斑马鱼为模型,利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统,敲除预测的Nondret002679基因启动子区以沉默Nondret0026 79基因的表达,研究IncRNA基因Nondret0026 79在斑马鱼中的调控功能.首先利用启动子区上下游序列设计靶向不同位点的向导RNA(guide RNA) gR1、gR2、gR3、gR4、gR5和gR6.人工合成gRNA转录模板,体外转录为gRNA,与Cas9 mRNA一起显微注射到斑马鱼卵中.PCR鉴定28尾2月龄斑马鱼发现,11尾发生敲除,敲除率为39％.繁殖启动子区敲除的杂合鱼,获得33尾F1代,经鉴定有6尾F1斑马鱼启动子区缺失,其中3尾缺失是在两条同源染色体上.该初步研究表明,CRISPR/Cas9系统可高效敲除lncRNA基因的启动子区,并且这种敲除可以遗传至下一代,为研究lncRNA功能提供了一个有效的基因编辑工具. 相似文献
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原核注射技术已经是目前制备转基因小鼠(Mus musculus)最有效的手段,但不同实验室所报道的转基因效率差异较大,效率不高仍是该技术的主要缺点.为提高转基因小鼠的制备效率,本研究对转基因小鼠制备过程中的原核注射的多个方面都进行了改进,尤其是在注射针直径、外源基因浓度、单/双原核注射以及胚胎移植等主要步骤上的进行了优化.实验结果表明,不同浓度的外源基因对转基因小鼠的阳性率有很大影响.外源基因为1.00、2.50、3.00和4.00 μg/mL浓度时,转基因小鼠阳性率分别0.67％、14.9％、30.6％和21.4％.其中,外源基因浓度在3.00 μg/mL极显著高于其他各组(P＜0.01).采用阳性率最高的3.00 μg/mL浓度又进行了单双/原核注射比较,发现转基因阳性率在进行双原核注射组显著高于单原核注射组(24.3％ vs.18.3％,P＜0.01).将显微注射后的2细胞时期胚胎经输卵管移植到0.5、1.5和2.5d假孕母鼠体内,产仔率分别为68.6％、67.6％和40.1％,转基因阳性率为17.4％、22.5％和10.1％.比较发现,0.5 d与1.5d代孕母鼠产仔率没有差异,但1.5d代孕组转基因阳性率(22.5％)显著高于其他组.结果表明,采用尽可能细的注射针、2～4 μg/mL的DNA载体浓度、双原核注射、1.5d的假孕母鼠和正确的胚胎移植操作,是获得高效率转基因小鼠的关键.本研究对从事动物转基因技术研究的实验室提供一些有益的借鉴. 相似文献
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验证了一种简便易行的斑马鱼性腺体表注射方法。首先解剖10条成年斑马鱼,精确测量并勾画出性腺的综合体表投影;然后注射阿尔新蓝染料确定注射路径和范围;再分别注射葡聚糖德克萨斯红和Sox9amyc过表达质粒与脂质体转染试剂混合物,48 h后分别用荧光显微镜和免疫印迹法检测荧光分布和融合基因表达。根据雄性斑马鱼平均体长、体宽和性腺的平均长宽,确定注射点位于斑马鱼胸鳍上端水平线与腹鳍前端竖直线相交处向上0.1 cm处。注射48 h后,发现阿尔新蓝和葡聚糖德克萨斯红多存在于性腺内部,部分标记了周围器官边缘部位;证实Sox9a-myc蛋白在卵巢中大量表达。结果表明建立的斑马鱼性腺体表投影体侧注射方法有效可行,为以后斑马鱼的体内基因调控研究提供了简便易行的给药途径。 相似文献