抗菌肽分泌型载体的构建及转基因马铃薯中蛋白的胞外分泌   总被引：10，自引：0，他引：10  

王志兴  贾士荣 《农业生物技术学报》1996,4(3):277-286

马铃薯青枯病是一种维管束病害。为使抗菌肽分泌到细胞外以提高抗菌能力，将抗菌肽ｍ Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ或Ｓｈｉｖａ Ａ基因分别和大麦（淀粉酶的信号肽序列连接后，克隆到经改造的植物表达载体ｐＢＩ１２１中，构建成分泌型表达载体。经冻融法转入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，叶盘法转化马铃薯栽培品种米拉，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明外源基因已整合到马铃薯基因组中。用透射电镜观察到加接信号肽序列的转基因植株茎、叶的细胞  相似文献   

信号肽对溶血素在大肠杆菌中跨膜转运的影响     

齐安生  张秀娟  宫枫举  张兴进  马喆  潘子豪  孙学强 《中国动物检疫》2018,35(3):67-71

信号肽在引导外源蛋白的跨膜转运过程中具有重要作用。本试验通过PCR方法获得带有信号肽序列和不带有信号肽序列的溶血素基因,构建表达载体在大肠杆菌中进行诱导表达。经过溶血试验和免疫印迹试验证明缺失了信号肽的重组溶血素不能被跨膜转运至细胞外;带有信号肽的重组溶血素能够跨膜转运大肠杆菌细胞外。本试验为猪链球菌2型基因缺失弱毒疫苗的研究、细菌信号肽以及基因工程重组蛋白的可溶性表达进行了有益探索。  相似文献   

全细胞催化剂pelB⁃Xln⁃DT构建及其在水解三七皂苷R1中的应用     

李琦  童欣怡  蒋玉洁  裴建军  赵林果 《林业工程学报》2020,5(4)

设计带有EcoRV和XhoI酶切位点的上下游引物PCR扩增嗜热菌Dictyoglomus thermophilum DSM 3960的GH39家族的β-木糖苷酶Xln-DT编码基因,利用基因拼接技术将其重组至p ET-20b质粒中pelB信号肽基因的下游,重组质粒转化大肠杆菌表达宿主Escherichia coli BL21,构建分泌融合表达型基因工程菌pelB-Xln-DT。经异苯基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,pelB-Xln-DT酶活为2.1 U/m L。粗酶液pelB-Xln-DT的最适温度为85℃,较原酶提高了10℃,最适p H为5.5,比原酶降低了0.5; pelB-Xln-DT在85℃下的热稳定性比原酶有了一定提高,保温1 h后酶活基本不变,保温2 h其剩余酶活为82.0%,而Xln-DT在85℃下保温1 h后其剩余酶活为70.4%;在p H 4.0～7.0的范围内,pelB-Xln-DT具有良好的p H稳定性。引入pelB信号肽后不但能够提高蛋白的可溶性表达,还能提高酶蛋白的热稳定性。以pelB-Xln-DT作为全细胞催化剂转化三七皂苷R1生成人参皂苷Rg1,研究了转化温度、转化时间、三七皂苷R1添加量、重复次数等因素对转化效率的影响。结果表明,全细胞催化剂用量1.0 U/m L,在温度37℃下,3 g/L的三七皂苷R1反应3 h后的摩尔转化率达到91.6%,重复利用10次后,转化率仍能达到46.7%,显示出pelB-Xln-DT良好的重复催化性能。  相似文献   

16种微生物蛋白酶的生物信息学分析     

富玉竹  李欣  李晔  王斯德  金丽华  于然 《江苏农业科学》2020,48(4):65-72

蛋白酶(protease)是以降解蛋白质为主的糖苷酶,具有丰富的多样性,在生物有机体中发挥着重要而又广泛的作用,具有广泛的研究和应用价值。本研究采用ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1 server和NPSA serve等生物信息学软件,对天蓝色链霉菌、普通拟杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌等16种微生物蛋白酶的理化性质、蛋白结构、系统发生树和功能域等进行了分析。结果表明:通过分析16种微生物蛋白酶的稳定性发现,金黄色葡萄球菌、唾液链球菌、短小芽孢杆菌、绿脓杆菌为不稳定蛋白;二级结构由α螺旋、β转角、无规则卷曲和延伸链等结构元件组成;除了节杆菌属、无乳链霉菌、普通拟杆菌、肠杆菌属具有信号肽,其余蛋白酶氨基酸序列不具有信号肽的特点。可以推测出蛋白酶为非分泌性蛋白;只有绿脓杆菌和猪链球菌有跨膜结构,剩下其余几种微生物均没有跨膜结构。具有2个蛋白功能域,分别为Peptidase S8 familyi、Fn3_5like domain。  相似文献   

猪链球菌蛋白表面展示系统的构建及展示蛋白的初步观察     

黄萌萌  刘冉  陈平  朱金鲁  卫东  谢芳  李刚  刘思国  张跃灵 《中国预防兽医学报》2020,(2):105-113

为构建猪链球菌(Streptococcus suis)蛋白表面展示系统,本研究通过序列分析,确定猪链球菌的LPxTG蛋白及其信号肽(SP)和胞壁锚定基序(CWA),通过PCR扩增Peno-SP、GFP、CWA的DNA片段并融合,构建强启动子Peno控制表达编码SP-GFP-CWA融合蛋白的DNA片段,将该重组DNA片段连接pSET2载体,获得蛋白表面展示质粒,转化猪链球菌,构建得到以GFP为报告蛋白的猪链球菌蛋白表面展示系统。结果显示,利用猪链球菌的10个LPxTG蛋白及其SP和CWA序列,构建了10个含有Peno-SP-GFP-CWA融合片段的重组pSET2表面蛋白展示质粒pSsPSD1至pSsPSD10,分别转化猪链球菌05ZYH33,PCR鉴定显示其中7个转化猪链球菌。采用western blot初步检测其展示蛋白,结果显示,7个转化阳性菌株均能有效表达GFP蛋白,以成熟GFP条带为指标,均表现出了一定的外源GFP表面展示水平,分别命名为SsPSD1、SsPSD2、SsPSD4、SsPSD7-SsPSD10,其中SsPSD1、SsPSD4、SsPSD8和SsPSD9表面展示水平相对较好,在猪链球菌表面展示外源蛋白方面具有很好的潜力。本研究首次尝试建立猪链球菌蛋白表面展示系统,为猪链球菌表面递呈外源蛋白或抗原提供了新的策略。  相似文献   

大熊猫IL-4基因的克隆与序列分析     

黄道超  杨光友  张志和  张安居  郭万柱  王成东  候蓉  沈富军  袁欣 《中国兽医学报》2008,28(5):549-552

应用RT-PCR技术从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫IL-4基因,并将其克隆到PGEM-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,结果表明,克隆得到的IL-4基因开放阅读框由396个核苷酸组成,编码一个由132个氨基酸组成的多肽,包括编码24个氨基酸的信号肽和108个氨基酸的成熟肽。与GenBank中已登录的大熊猫IL-4（DQ166512）的核苷酸序列同源性分别为99.5%和100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的IL-4核苷酸同源性为50.7%（鼠）～87.7%（犬）;IL-4编码氨基酸同源性在35.7%（鼠）～78.8%（犬）;进化树构建结果表明,大熊猫与犬、猫遗传距离最近。  相似文献   

以谷蛋白GluA-2信号肽增强外源蛋白在转基因水稻胚乳中的表达与积累     

王红梅  张昌泉  李钱峰  辛世文  刘巧泉  徐明良 《作物学报》2015,41(4):524-530

提高外源蛋白在特定目标组织器官中的表达量是转基因植物研究与开发的核心技术之一。谷蛋白是水稻种子中最主要的贮藏蛋白,其表达具有严格的时空特异性。为进一步研究谷蛋白信号肽序列在指导基因表达中的作用,本研究克隆了水稻谷蛋白Glu A-2基因的启动子及其信号肽编码序列,并与GUS报告基因编码区融合,构建了分别含有和不含有信号肽的表达载体p13GG和p13GSG;经农杆菌介导法分别转入同一水稻品种中,获得了20多个独立转化子,PCR证明外源基因都已整合进了水稻基因组中。Northern杂交结果表明,融合Glu A-2信号肽编码序列可显著提高GUS基因在水稻胚乳中的转录;利用GUS特异的抗体进行Western杂交分析,显示该信号肽序列可显著提高外源蛋白在转基因水稻胚乳中的积累,但是其所指导表达的GUS蛋白在水稻胚乳中并没有表现出相应的活性,其机制有待进一步深入解析。相关结果对于水稻品质改良基因工程研究以及以水稻种子作为生物反应器高效表达外源蛋白具有重要的指导作用。  相似文献   

溶菌酶基因合成及其原核表达          下载免费PDF全文

刘兴敏  何自福  李华平  虞皓 《华南农业大学学报》2007,28(1):55-57

根据T4噬菌体溶菌酶的氨基酸序列,选用植物偏爱的密码子设计并人工合成了溶菌酶基因,并在N-端加上23个氨基酸残基的α-淀粉酶信号肽序列和信号肽酶切位点HQP;用苷氨酸残基替代C-端的酰胺;新基因全长为576 bp,共编码190个氨基酸.为了检测该基因生物活性,将其克隆到原核表达载体pET28b( )中,导入宿主细菌E. coli BL21(DE3) pLysS,经IPTG诱导后,宿主细菌在2 h内全部被溶菌酶基因的表达产物裂解,说明该溶菌酶基因对细菌具有很强的抗性.  相似文献   

猪泛素C端水解酶L1基因的克隆与序列分析   总被引：1，自引：0，他引：1       下载免费PDF全文

田兴国  李加琪  陈瑶生  高萍  梅盈洁  凌飞  罗永发 《华南农业大学学报》2007,28(1):100-104

从人泛素C端水解酶L1(UCH_L1)基因出发,在dbEST数据库中同源搜索,找到1条与人UCH_L1基因编码氨基酸同源性较高且在香猪背最长肌中表达的EST(BM194679).通过电子克隆和进一步RT-PCR试验验证,获得猪UCH_L1基因全长cDNA序列,其全长 1 105 bp,开放阅读框(ORF)位于60～728 bp,编码223个氨基酸.同源性分析结果表明,与人、鼠UCH_L1基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为91.2%和86.5%,蛋白质序列同源性均为96.6%.对该基因编码蛋白的结构和功能预测显示含有2个典型的疏水性区域,不含有信号肽,存在1个UCH_L1(pfam01088)保守结构域和多个磷酸化位点,属UCH_L1蛋白家族,故将该基因命名为猪泛素C端水解酶L1基因(登录号AY495532).  相似文献   

稻瘟菌基因组规模分泌蛋白的预测分析   总被引：3，自引：0，他引：3  

苏源  李成云  赵之伟  周晓罡  李进斌  杨静  刘林  业艳芬 《云南农业大学学报(自然科学版)》2006,21(3):271-275,292

利用信号肽分析软件SignalP v3．0，亚细胞器蛋白定位软件TargetP v1．01，GPI-锚定位点软件big—PI Predictor和跨膜螺旋结构软件THMM-2．0这4个软件分析预测稻瘟菌12595个蛋白序列中有1134个分泌蛋白。编码这些蛋白的可读框（ORF）最小值为78bp，最大值为7849bp，平均1231bp。引导它们的信号肽长度介于15—45个氨基酸之间，平均为21个氨基酸。435个分泌蛋白具有功能描述，主要是与代谢有关的酶类。分析了其中降解细胞壁组分和与致病相关的酶类，提示在稻瘟菌侵染水稻不同阶段产生的关键酶及基因的功能需进一步研究。  相似文献