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副溶血弧菌和霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用 总被引：2，自引：0，他引：2
建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重荧光定量PCR方法。根据副溶血弧菌toxR基因和霍乱弧菌ompW基因设计特异性引物与TaqMan探针。toxR和ompW探针5'端分别标记FAM、CY5荧光报告基团,3'端均标记BHQ1荧光淬灭基团。结果显示:该方法的副溶血弧菌和霍乱弧菌最低检测限均达到10 CFU/m L,灵敏度高;特异性试验表明这两种细菌与其他病原菌(大肠杆菌O157、沙门氏菌、拟态弧菌、创伤弧菌)无交叉反应;批间和批内重复性实验表明变异系数均小于1.5%,说明重复性好。采用人工染菌虾肉样品,副溶血弧菌和霍乱弧菌的最低检测限分别为100 CFU/m L和50 CFU/m L,人工染菌贝类样品的最低检测限分别为50 CFU/m L和50 CFU/m L。两种细菌在虾肉中富集2 h后的最低检出限均为1 CFU/m L。结论:本研究所建立的双重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点,包括DNA提取的整个检测过程可在1至3 h内完成,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效手段。 相似文献
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为探明引起贵州省某鸭场雏鸭发病的病原及其致病性和耐药情况，本研究对该鸭场送的疑似细菌感染病鸭进行剖检，取鼻黏膜、心脏和肝脏等组织器官接种于培养基中进行细菌分离鉴定，通过对分离菌进行药敏试验、动物回归试验和毒力基因检测研究其耐药情况和致病性。结果显示，分离菌在血琼脂培养基上生长16 h后呈现为边缘整齐、有光泽的乳白色菌落，伴有β-溶血现象，经革兰氏染色后在生物显微镜下呈两端钝圆、弧状、排列无规则的革兰氏阴性短小杆菌，与霍乱弧菌相符；16S rDNA基因序列同源性及系统进化树显示，该分离菌与霍乱弧菌同源性高达99.6%~99.7%聚为一支；药敏试验结果显示，分离菌对大部分药物都表现为耐药，其中对氨苄西林、克林霉素、复方新诺明、苯唑西林和克林霉素等抗菌药耐药性较强，对头孢哌酮和头孢曲松敏感；动物回归试验显示，分离菌可导致试验组雏鸭5 d内全部发病死亡，表明该分离菌对雏鸭具有较强的致病性；毒力基因PCR检测结果显示，检测的霍乱弧菌相关毒力基因hlyA、ompW和chxA为阳性，而检测的O1群rfb、O139群rfb、tcpA及ctxA基因为阴性，表明本次分离的霍乱弧菌携带有致病基因，但不属于O1和O139血清群。结果表明，该鸭场雏鸭发病的疫情病原为非O1/O139血清群霍乱弧菌，该菌致病性强且对多种抗菌药物耐药。本试验结果为贵州省鸭霍乱弧菌病的防控提供了参考依据。 相似文献
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用PCR扩增了MBP—ZOT质粒上的ZOT基因，该基因编码264～399位氨基酸残基C末端的15ku △G片段，并与经改造后的质粒P^BCX、连接。将重组后的质粒PMLAG在大肠杆菌BL21中表达，将表达的目的蛋白纯化，再将p^BCX-△G片段与传染性腔上囊炎病毒VP2包涵体蛋白通过滴鼻免疫途径对14日龄SPF鸡进行联合免疫试验，分别于免疫后第10、20d采集血清样品，进行ELISA试验，检测免疫后IBD抗体效价。动物免疫试验发现：融合蛋白P^BCX △G起到了明显免疫增强效果，与VP2重组蛋白联合免疫2次后，血清IBD的VP2 IgG抗体效价是单独用VP2免疫组的3倍，明显高于空白免疫组。 相似文献
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采用一种新型的引物设计方法——双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide,DPO）,以霍乱弧菌mdh基因为靶序列,建立了霍乱弧菌DPO-PCR特异性检测方法,分析了DPO引物退火温度不敏感性、检测灵敏度及特异性,并对检测方法进行了初步应用。灵敏度结果显示,DPO-PCR方法对霍乱弧菌的最低检出限为1.07×10^2 CFU/mL。退火温度不敏感性试验中,与常规PCR引物相比,DPO引物在45～65℃退火温度均能够高效扩增出靶基因片段。特异性结果显示,DPO-PCR方法的特异性比常规PCR方法强,不产生任何非特异性扩增。利用建立的霍乱弧菌DPO-PCR检测方法对采集的550份样本进行检测,检出43份霍乱弧菌阳性样本,经行业标准法（SN/T2425-2010）复检,检测结果相同,表明所建立的DPO-PCR检测方法具有良好的实用性,为霍乱弧菌的快速准确检测提供了新途径。 相似文献
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对昆明口岸进口的水产品进行了霍乱弧菌监测。共抽查检验386批，其中4批检出O1群霍乱弧菌(稻叶型和小川型各2批)，检出率1．0％。监测结果表明，来自泰国的进口竹节虾存在被致病性霍乱弧菌污染的可能性，有引起霍乱疾病传染的危险。 相似文献
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对进口食用活蛇鳗抽样进行实验室检验,经增茵培养、细菌分离和纯培养,分离出一株疑似霍乱弧菌。经镜检、生化试验、血清凝集试验和动物毒性试验,鉴定为非O1群霍乱弧菌。这在汕头口岸进出口动物水产品检验检疫中,属首次报道。 相似文献
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2001年1月-2002年6月,昆明口岸进口水产品霍乱弧菌监测共抽查检验386批,其中4批检出01群霍乱弧菌(稻叶型和小川型各2批),检出率1.0%.监测结果表明,来自泰国的进口竹节虾存在被致病性霍乱弧菌污染的可能性,有引起霍乱疾病传染的风险. 相似文献
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目前南美白对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）人工养殖中,病害多发,本研究从一养殖场中采集发病病虾,从患病对虾肝胰腺中分离病原菌．对分离菌株进行形态观察,生理生化测定并结合１６ＳｒＤＮＡ序列分析进行鉴定,结果表明,该分离菌为霍乱弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａ）,回归感染证明其为致病菌,可导致南美白对虾死亡．通过纸片琼脂扩散法对３２种抗生素进行药物敏感试验,病原菌对氟苯尼考、氯霉素、利福平、诺氟沙星等１０种抗生素敏感,对头孢呋辛、头孢曲松等７种药物中度敏感,对羧苄西林、青霉素等１５种药物具有抗性．通过二倍稀释法测定筛选５种常用抗生素最小抑菌浓度,结果表明诺氟沙星抑菌效果最强,最小抑菌浓度最小＜０.２４４１μｇ／ｍＬ． 相似文献