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1.
旨在制备毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)配子体抗原EnGAM22单克隆抗体,用Ni-NTA亲和层析纯化的重组抗原rEnGAM22免疫BALB/c小鼠,免疫3次后,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用预先建立的ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行4次亚克隆后,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株并命名为2F3和3D3;对单抗亚类和特异性进行鉴定,应用单抗识别天然蛋白和虫体定位。结果显示,单克隆抗体2F3和3D3亚类分别为IgG2a、IgG2b,纯化后腹水效价分别为1:256 000、1:64 000,能特异性识别重组抗原rEnGAM22和毒害艾美耳球虫天然配子体蛋白;免疫荧光定位显示单克隆抗体2F3和3D3能特异性识别大配子体的成壁体和卵囊壁,表明EnGAM22抗原参与卵囊壁的形成。制备的单克隆抗体为研究球虫卵囊壁形成的分子机制奠定了基础。 相似文献
2.
《中国兽医学报》2017,(5):854-858
利用聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳技术,分析了毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊壁可溶性蛋白。用鼠抗毒害艾美耳球虫重组配子体蛋白rEnGAM56和rEnGAM59多克隆抗体,对卵囊壁可溶性蛋白进行了Western blot分析。结果显示,至少有24条较清晰的电泳条带,其中6条为相对明显的主带,其相对分子质量分别为37 000,35 000,34 000,20 000,14 000和12 000。Western blot分析显示,鼠抗rEnGAM59和rEnGAM56多抗均能识别1条条带,前者的相对分子质量约14 000,后者约30 000。推测30 000和14 000卵囊壁蛋白分别来自毒害艾美耳球虫配子体蛋白EnGAM56和EnGAM59。 相似文献
3.
顶复门原虫的AP2结构域蛋白(ApiAP2)可能是调控虫体生长发育的转录因子。本研究旨在克隆、表达毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子，检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫第3代裂殖子的总RNA为模板，RT-PCR扩增毒害艾美耳球虫EnApiAP2基因后，连接至pMD18-T载体，测序后构建pET28a (+)-EnApiAP2表达载体，转化至表达菌BL21(DE3)，重组菌经测序鉴定后诱导表达，并纯化复性重组蛋白。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠抗rEnApiAP2多克隆抗体。利用多克隆抗体，分别用Western blot和间接免疫荧光试验检测裂殖子中天然EnApiAP2蛋白及其定位。最后，应用荧光定量PCR分析EnApiAP2基因在第2、3代裂殖子中的转录水平。结果显示，该基因全长1 830 bp，编码610个氨基酸，含有一个AP2结构域，预测分子质量67.69 ku；重组蛋白大小约为74 ku，主要以包涵体形式存在，可以被6×HIS标签单抗、鸡抗毒害艾美耳球虫康复血清和鸡抗柔嫩艾美耳球虫康复血清识别；在第3代裂殖子中检测到天然EnApiAP2蛋白，分子质量约为85 ku；EnApiAP2蛋白定位在第2、3代裂殖子细胞核内；第3代裂殖子EnApiAP2转录水平显著高于第2代裂殖子(P<0.01)。成功克隆、表达了EnApiAP2基因，证实该基因表达的蛋白定位在裂殖子的细胞核内，为进一步研究EnApiAP2蛋白的转录因子功能奠定了基础。 相似文献
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5.
《畜牧与兽医》2020,(11)
提取柔嫩艾美耳球虫(扬州株)配子体基因组DNA,PCR扩增配子体基因Etgam56,经克隆和序列分析后,优化密码子,连接至pET-28a(+),构建原核表达载体pET-28a(+)-Etgam56,优化条件进行体外诱导表达,Western blot分析其抗原性。结果显示,Etgam56基因全长1 425 bp,为一个完整开放阅读框,共编码474个氨基酸;体外表达重组蛋白的大小约为56 ku,IPTG终浓度为0.10 mmol/L,37℃诱导3 h时的表达量最高,且主要以包涵体形式存在。Western blot结果显示,该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体、柔嫩艾美耳球虫鸡康复血清和毒害艾美耳球虫鸡康复血清识别,表明该重组蛋白为特异性表达的蛋白,具有很好的抗原性和交叉反应性。本研究将为进一步探析柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白的功能与研制鸡球虫基因工程疫苗奠定基础。 相似文献
6.
《中国预防兽医学报》2015,(10)
本研究以黄羽肉鸡为实验动物,以死亡率、平均肠道病变记分、平均增重、相对增重率、相对卵囊产量、抗体水平等为评价指标,分别研究了毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫(两者在裂殖生殖阶寄生部位相同)、毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫(两者在配子生殖阶段寄生部位相同)间在免疫上的相互影响。结果显示:毒害艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫混合免疫的保护效果比毒害艾美耳球虫单独免疫好,虽略低于巨型艾美耳球虫单独免疫,但仍具有免疫保护性;毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫混合免疫的保护效果比毒害艾美耳球虫单独免疫好,与柔嫩艾美耳球虫单独免疫相比无明显差异。结果表明巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫对毒害艾美耳球虫的免疫均具有一定的协同效应;毒害艾美耳球虫对巨型艾美耳球虫的免疫有一定负面影响,而对柔嫩艾美耳球虫的免疫无影响。 相似文献
7.
鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害严重的肠道寄生虫病,每年都会给世界各地的养禽业带来巨大的经济损失。目前,该病主要依靠抗球虫药物进行防治,但由于药物的长期及不合理使用导致鸡球虫几乎对所有使用过的抗球虫药均产生耐药性。为研究球虫耐药性产生的分子机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因,发现柔嫩艾美耳球虫含HD域蛋白（EtHDCP）在耐药株中上调表达。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板,成功克隆出EtHDCP基因,构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtHDCP,并成功诱导表达了重组蛋白rEtHDCP。利用qRT-PCR和Western blot对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段的转录和翻译水平进行分析,结果显示,EtHDCP在第二代裂殖子的转录和翻译水平高于其他三个阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子）。同时利用Western blot分析了EtHDCP在柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株中的翻译水平,结果显示,EtHDCP在耐药株中的蛋白翻译水平显著高于敏感株。间接免疫荧光定位结果显示,该蛋白主要定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞质内。入侵抑制试验表明,抗rEtHDCP多克隆抗体可有效抑制子孢子对宿主细胞的入侵。这些结果说明该蛋白可能参与了虫体在宿主细胞内的生长发育、耐药性的产生以及子孢子入侵宿主细胞的过程。 相似文献
8.
利用本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）孢子化卵囊和未孢子化卵囊差异表达ESTs序列,选取编号为BW4-C03的孢子化卵囊,采用RACE技术,获得该基因全长序列。经BLAST分析,该序列与柔嫩艾美耳球虫表面抗原有72%以上的同源性,命名为EtSAG。利用荧光定量PCR（Real-time PCR）检测发现该基因在孢子化卵囊的转录拷贝数最高,且随着孢子化时间的延长,转录拷贝数逐渐增加。采用原核表达载体pET-28C表达该基因,得到的融合蛋白大小约为36 kDa,符合预期大小。经Western blot分析,该重组蛋白可被兔抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因原核表达重组蛋白的免疫效力,分析其在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中对鸡平均增重、抗球虫指数(ACI)、减少盲肠病变和卵囊数量中的作用,从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA作为模板,用RT-PCR扩增出SO7基因片段,再应用DNA重组技术将SO7基因克隆到原核表达载体pET32a(+)中并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,pET32a(+)-SO7表达的目的蛋白约为40ku,主要以包涵体形式存在。用纯化的重组蛋白进行动物免疫试验显示,SO7重组蛋白在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中有较好的免疫保护作用,能够显著提高鸡柔嫩艾美耳球虫感染鸡的平均增重和抗球虫指数(ACI),对减少盲肠病变和卵囊数量也有部分作用。 相似文献
10.
为了建立毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)的鸡胚培养体系,用毒害艾美耳球虫子孢子分别接种8～11日龄鸡胚以确定最佳接种日龄,用不同剂量子孢子接种同一日龄鸡胚以确定最佳子孢子接种剂量,并在子孢子混悬液中分别加入不同剂量的胰岛素和叶酸以观察对球虫在鸡胚中发育的影响.结果显示,毒害艾美耳球虫子孢子接种9日龄的鸡胚,其卵囊产量(平均每只胚的卵囊量)和卵囊成熟率均为最高,成熟率达到99%;当每个鸡胚接种子孢子1×104个时,其卵囊产量最高;在子孢子混悬液中分别加入胰岛素1 000 U/mL、叶酸0.05 mg/mL,均能明显增加鸡胚中的卵囊产量.本文通过对毒害艾美耳球虫的鸡胚接种日龄、子孢子接种剂量、营养物质添加等因素的研究,初步建立了毒害艾美耳球虫的鸡胚培养体系. 相似文献
11.
HOU Ning LV Zhi-hui ZHAO Liang GAO Xue-li LIU Chao-nan LV Xiao-ping ZHENG Shi-min 《中国畜牧兽医》2015,42(8):2183-2188
The 90 chickens were randomly divided into control group, E.necatrix one time infection group and E.necatrix two times infection group.We used duplex PCR method to test the expression changes of HSP-90 mRNA in intestinal tissue of chickens infected with E.necatrix and researched the effects of it comprehensively and systematically.The results were showed that after 0 to 14 days the expression of HSP-90 mRNA in intestinal tissues of 14-day-old chickens infected with E.necatrix presented a upward trend though it was lower than the control chickens.These chickens were infected with E.necatrix again at 28 days, HSP-90 mRNA expressions of duodenum, jejunum and ileum decreased and then increased.However, it always showed a downward trend in appendix.When 28 days chickens were infected with high-does E.necatrix once, HSP-90 mRNA expressions of duodenum, jejunum and appendix were in a declining curve.While it was increased originally and then decreased in ileum.This study indicated that HSP-90 mRNA expressions in intestinal tissue of chickens infected with E.necatrix were inhibited at first, and the expression quantity was closely related to the degrees of intestinal tissue damage. 相似文献
12.
【目的】实现A型塞内卡病毒（Seneca virus A,SVA）VP1蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,以建立SVA抗体液相芯片技术检测方法。【方法】根据GenBank收录的SVA VP1基因序列（登录号：KY747514.1）,基于大肠杆菌的密码子偏好性优化合成VP1基因,克隆到pCold TF载体,构建重组质粒pCold TF-VP1。将重组质粒pCold TF-VP1转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,进行IPTG诱导表达。通过优化诱导时间及IPTG浓度得出最佳诱导表达条件。采用His标签镍柱纯化VP1重组蛋白,将纯化后的SVA VP1蛋白与荧光微球进行偶联,偶联好的微球与阴阳性血清反应,利用Luminex 200系统上机检测背景及阴阳性血清的中值荧光强度（MFI）,从而判断阴阳性,以用于猪血清中SVA抗体的检测。【结果】重组质粒pCold TF-VP1成功转入大肠杆菌BL21感受态细胞,并以可溶性蛋白形式表达。经诱导表达在约82 ku处出现阳性条带。当重组菌株诱导条件为16 ℃、IPTG终浓度为1.2 mmol/L、诱导时间为3 h时,VP1蛋白表达量最高;经Western blotting分析,可在82 ku处出现明显条带。将VP1 蛋白与荧光微球偶联,阴性对照（背景）的平均荧光值为17（＜100）。测试孔的平均MFI为2 339.5（＞2 000）,证明SVA VP1蛋白与微球偶联成功,偶联成功的荧光微球可用于检测猪血清中SVA抗体的检测。【结论】本研究在大肠杆菌中成功表达并纯化了SVA VP1蛋白,初步建立了SVA抗体液相芯片检测方法,为后续研究奠定了基础。 相似文献
13.
Interferon (IFN) had recieved much more attention because of its broad-spectrum antiviral, antitumor activity and immune regulation.One pair of primers were designed for amplifying pig IFN-δ gene with PCR method according to the relevant sequence from GenBank.The IFN-δ gene was cloned into prokaryotic expression vector, and the recombinant plasmid was obtained.We transformed the recombinant plasmid into E.coli Transetta BL21(DE3) strain and the protein expression was identified by SDS-PAGE and Western blotting.The results showed that pET-30a-DsbA-IFN-δ recombinant protein was 20 ku and expressed mainly in the form of inclusion body, these expressed protein could specific react with His-tag monoclonal antibody. 相似文献
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本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒（PEDV）S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段（S2A）,将其克隆后插入原核表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37 ℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1：32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。 相似文献
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将90只海蓝褐雏鸡随机分为对照组、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)一次感染组和毒害艾美耳球虫两次感染组,应用二重PCR方法,通过对肠道组织热休克蛋白-90 (HSP-90) mRNA表达的检测,较全面系统地研究了毒害艾美耳球虫感染对雏鸡肠道组织HSP-90 mRNA表达的影响。结果发现,14日龄雏鸡经口第一次感染毒害艾美耳球虫后0~14 d,其肠道组织HSP-90 mRNA表达虽然不同程度的低于对照雏鸡,但总体呈上升趋势;上述雏鸡于28日龄时再次攻击性感染毒害艾美耳球虫,其十二指肠、空肠和回肠HSP-90 mRNA表达均呈先下降后上升,而盲肠HSP-90 mRNA表达始终呈下降趋势。28日龄雏鸡一次性大剂量感染毒害艾美耳球虫后,其十二指肠、空肠、盲肠HSP-90 mRNA表达均下降,而回肠HSP-90 mRNA表达先下降后上升。结果表明毒害艾美耳球虫感染雏鸡初期,肠道组织HSP-90 mRNA表达受到一定抑制,其表达量与肠道组织细胞损伤程度密切相关。 相似文献
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This assay was aimed to express the PuAH gene of Edwardsiella tarda (E.tarda) EIB202 and analyze its partial characteristics.A pair of specific primers was designed based on the PuAH gene sequence of E.tarda published in GenBank(accession No.:CP001135,CDS No.:ETAE_0818).The gene was cloned and expressed by recombinant plasmid pET32a-PuAH in E.coli BL21(DE3).The recombinant protein was purified and used to immune New Zealand rabbits to prepare antisera.Then the characteristics of expression product and antisera were analyzed by ELISA,Western blotting,hemolysis test and bacterial agglutination test.In conclusion,the expression product was fusion protein with 42 ku molecular weight,and had immunogenicity and antigenicity,but no hemolytic to erythrocytes of eel.Yet the antisera could inhibited the hemolytic of outer membrane protein of E.tarda EIB202 to some extent,and could agglutinate E.tarda EIB202. 相似文献
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干扰素(interferon,IFN)因具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节作用而备受关注。本研究根据GenBank上公布的猪IFN-δ核苷酸序列设计1对引物,通过PCR方法扩增出猪 IFN-δ基因,片段大小为513 bp,并将其克隆到原核表达载体上得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta BL21(DE3)受体菌,经SDS-PAGE电泳分析,结果表明,pET-30a-DsbA-IFN-δ表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约20 ku,且主要以包涵体形成存在,经Western blotting分析发现表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。 相似文献
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本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。 相似文献