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1.
广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。 相似文献
2.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(9)
为了克隆广西巴马小型猪硫氧还蛋白相互作用蛋白基因(TXNIP)序列并构建真核表达载体,为生产转TXNIP基因的广西巴马小型猪奠定基础,试验采用RT-PCR技术从广西巴马小型猪胰腺组织中扩增出TXNIP基因编码序列,连接至p MD18-T载体,测序鉴定后提取质粒,用SalⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切,回收的TXNIP片段连接至p EGFP-C1载体上,构建含TXNIP的真核表达载体p EGFP-C1-TXNIP;利用双酶切和测序对重组质粒p EGFP-C1-TXNIP进行鉴定,并将重组质粒转染β-TC6细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。结果表明:广西巴马小型猪TXNIP基因编码区序列长1 176 bp,编码391个氨基酸,与Gen Bank已公布的猪TXNIP基因c DNA序列(序列号为DQ278874)对应区段同源性为99.7%;重组表达载体p EGFP-C1-TXNIP质粒转染β-TC6细胞能表现出绿色荧光。 相似文献
3.
《畜牧兽医学报》2015,(5)
本研究旨在探究关岭牛4个不同长度的MyoD I启动子的启动活性,初步确定该基因核心启动子位置。采用实时荧光定量PCR技术对关岭牛不同组织中MyoD I基因的相对表达量进行检测。以关岭牛血液DNA为模板,设计5'端加磷的引物,PCR扩增获得4个不同长度的关岭牛MyoD I启动子,定向精确替换pEGFP-N3载体的CMV启动子区,构建重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I。利用脂质体法将重组质粒瞬时转染小鼠C2C12细胞,依据小鼠C2C12细胞发光的强弱判断MyoD I启动子的启动活性。结果显示,MyoD I基因在关岭牛肌肉组织中表达量较高;目的片段成功替换pEGFP-N3载体的CMV区;重组质粒能在小鼠C2C12细胞中成功表达,细胞在激发光下发绿色荧光。本研究成功构建了重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I,4个启动子均具有启动活性,其中P3启动子在小鼠C2C12细胞中表达量最高,初步推断P3启动子为该基因的核心启动子。 相似文献
4.
根据GenBank中公布的猪Oct4核苷酸序列设计合成1对引物,采用RT-PCR方法从巴马小型猪睾丸组织扩增Oct4基因编码全序列。然后将该基因重组于含有绿色荧光报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-Oct4重组质粒,通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明重组质粒构建成功。使用脂质体2000将pEGFP-Oct4转染巴马小型猪肾脏成纤维细胞,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染细胞株中可检测到Oct4的转录。结果表明,成功构建了真核表达载体pEGFP-Oct4,并可在巴马小型猪肾脏成纤维细胞中表达,为进一步研究Oct4基因生物学功能奠定了基础。 相似文献
5.
本研究旨在对广西巴马小型猪骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic proteins 2,BMP2）基因进行克隆及其结构和功能的预测,并检测其在广西巴马小型猪和长白猪中的表达差异。以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,通过测序鉴定BMP2基因外显子区的单核苷酸多态性（SNPs）,利用多种生物信息学软件对广西巴马小型猪BMP2基因启动子区、编码区（CDS）、3'UTR区进行了分析,预测分析广西巴马小型猪BMP2基因编码蛋白的基本理化性质、磷酸化位点、O-糖基化位点、跨膜区域、亲疏水性、蛋白质修饰结构、二级结构和三级结构等,并对miRNA结合位点及其相关通路进行分析,绘制了广西巴马小型猪和长白猪的组织表达谱。结果显示,试验成功克隆了广西巴马小型猪BMP2基因CDS区,总共1 188 bp,编码395个氨基酸;与猪参考基因组相比,广西巴马小型猪BMP2基因在G1663A、G1897C发生了同义突变,在C1896T（Pro→Leu）、T1971C（Gly→Ser）、G2000A（Leu→Ser）发生了3处错义突变;在3'UTR区域存在miR-142-5p、miR-129-5p等共13个miRNA结合区域;相似性比对结果显示,广西巴马小型猪与野猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、马、澳洲野犬、家犬、猕猴对应区段的相似性依次为99.92%、91.75%、91.84%、91.92%、91.92%、90.50%、89.43%、90.91%和90.91%;系统进化树结果表明,广西巴马小型猪与野猪的亲缘关系最近,与黄牛的亲缘关系相对较近,与猕猴亲缘关系较远;BMP2蛋白分子质量为44.55 ku,理论等电点为8.37,预测其有12个O-糖基化位点,42个磷酸化位点;预测分析发现该蛋白为亲水性蛋白,且是膜外蛋白。组织表达谱发现,广西巴马小型猪生长板软骨中BMP2基因表达量显著低于长白猪（P<0.05）。该研究为进一步探索广西巴马小型猪中BMP2基因的功能提供了理论基础,也为广西巴马小型猪品种资源的利用提供了重要参考。 相似文献
6.
通过构建猪核转录因子C/EBPβ编码区真核表达体pEGFP-N1-C/EBPβ,将猪C/EBPβ异位表达于小鼠成肌细胞C2C12细胞中,为进一步研究C/EBPβ在猪脂肪发育中的调控机制奠定基础。本试验利用RT-PCR扩增C/EBPβ编码区序列并测序,提交GenBank;并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过双酶切和测序鉴定重组质粒。将重组表达体pEGFP-N1-C/EBPβ导入C2C12细胞,荧光显微镜下观察C/EBPβ在细胞中的定位,半定量RT-PCR和Western blot检测C/EBPβ在细胞中的表达情况。本试验成功克隆测序了猪C/EBPβ基因编码区序列,并首次上传到GenBank;成功构建猪C/EBPβ真核表达体pEGFP-N1-C/EBPβ,并将其异位表达。结果表明:猪C/EBPβ在脂肪组织中表达量丰富,心肌和背最长肌表达微量,并且正确插入真核表达载体pEGFP-N1,荧光显微镜下观察重组体组主要集中在细胞核;而C/EBPβ基因和蛋白在转染重组体C2C12细胞中均有表达。本研究为提高猪肉肌内脂肪含量方面的研究提供新的思路。 相似文献
7.
为了阐明Smad4基因在水牛卵巢颗粒细胞增殖及胚胎发育中的分子机制,试验采用RT-PCR扩增并克隆水牛Smad4基因,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,构建Smad4基因的真核表达载体,通过脂质体转染法转染体外培养的牛卵巢颗粒细胞。结果表明,试验克隆得到水牛Smad4基因编码序列,编码区全长为1 662 bp,编码553个氨基酸。通过BLAST对水牛Smad4基因的核苷酸序列进行同源性比对,结果显示,水牛Smad4基因与牛的同源性为99%,与绵羊、猪、马、人的同源性分别为98%、96%、96%和95%。系统进化树分析表明,Smad4基因在不同物种的进化过程中具有高度的保守性。试验成功构建了水牛Smad4基因的真核表达载体pEGFP-N1-Smad4,并在水牛卵巢颗粒细胞中表达出较强的绿色荧光蛋白Smad4-EGFP融合蛋白。本研究成功克隆了水牛Smad4基因,并成功构建了Smad4基因的真核表达载体,为进一步研究Smad4基因在水牛胚胎发育过程中的分子机制奠定基础。 相似文献
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本研究旨在对广西沼泽型水牛MYF5基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体。应用RT-PCR方法从水牛肌肉组织中扩增MYF5基因,测序鉴定后对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体,并在细胞水平验证所构建载体的正确性。结果表明:水牛MYF5基因编码区序列长度为768 bp,编码255个氨基酸,其核苷酸序列与牛、山羊、猪、人、猩猩和狼相应序列的相似性分别为99%、98%、94%、91%、90%和89%;水牛MYF5基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;MYF5蛋白为膜外蛋白,具有MYOD家族标志性MYOD结构域;构建水牛MYF5基因真核表达载体pMXs-MYF5,转染HEK293T、水牛颗粒细胞后产生绿色荧光信号,表明细胞表达MYF5基因。 相似文献
9.
本研究旨在克隆通城猪含有第1个内含子的MSTN前肽基因,构建真核定点诱变载体,并通过转染C2C12细胞验证载体表达的有效性.以通城猪血液样品中提取的DNA作为模板,PCR扩增得到含第1个内含子的MSTN前肽基因,扩增产物进行克隆、测序.再将目的片段定向克隆到去除了EGFP基因的pEGFP-N1表达载体上.通过定点诱变方法将前肽编码序列第76位天冬氨酸突变为丙氨酸,获得定点诱变载体pEGFP(-)-N1-ProMstnD76A,并瞬时转染C2C12细胞.转染48 h后,通过RT-PCR和Real-time PCR方法检测目的基因的表达情况.结果表明:本研究成功克隆了通城猪含第1个内含子的MSTN前肽基因,并对该基因进行定点诱变修饰,构建了真核表达载体,转染后其前体mRNA能在C2C12细胞中进行正确剪接,目的基因mRNA表达水平较高.这为猪MSTN前肽基因在体内表达的研究奠定基础,并为制备转基因猪提供有用的分子材料. 相似文献
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《畜牧与兽医》2015,(1):76-81
为了获得稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞C2C12细胞株,将猪skMLCK基因cDNA序列T-A克隆至pMD-18T载体;重组质粒经双酶切后,定向克隆至真核表达载体,获得表达重组质粒pEGFP-N1-skMLCK;经脂质体介导,重组质粒稳定转染入C2C12细胞中;通过实时定量PCR方法检测skMLCK基因的表达水平,以及其他相关基因的表达情况。结果:获得了稳定表达猪skMLCK基因的C2C12细胞株;连续培养30d后,用实时定量PCR方法检测到skMLCK基因高表达,同时发现CFL2b和MEF2C基因表达下调。试验表明稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞系构建成功,为猪skMLCK基因功能的进一步研究提供了前期工作基础。 相似文献
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应用分子生物学方法、荧光显微镜和实时荧光定量PCR技术,对cripto基因进行克隆、真核表达载体的构建,探讨cripto对C2C12细胞生长增殖的影响和肌细胞分化相关基因MyoD、MyoG、P21、MHC的表达变化。结果显示,phiC31-cripto真核表达载体构建成功,荧光显微镜下可见转染phiC31载体和cripto基因共转染的C2C12细胞表达强烈的绿色荧光,且对细胞的生长增殖无显著性影响;Q-PCR检测MyoD、MyoG、P21、MHC结果证实,猪cripto可以促进细胞分化因子MyoD、MyoG、P21、MHC的表达。结果表明,本试验成功地构建了C2C12-phiC31-cripto过表达细胞系,Q-PCR结果分析发现cripto基因可以促进肌肉分化,为进一步探索cripto基因在肌肉分化中的分子机制提供理论依据。 相似文献
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广西巴马小型猪卵泡抑素的克隆及原核表达 总被引：1，自引：1，他引：1
从广西大学巴马小型猪卵巢中提取总RNA，并以其为模板，应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），在合成的特异性引物引导下，扩增获得广西巴马小型猪卵泡抑素（follistatin）cDNA的全序列，长度为1035 bp。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：广西巴马小型猪卵泡抑素cDNA序列与GenBank中已报道的家猪卵泡抑素同源性高达99.4%。同时，将目的基因插入到原核表达载体pET 32a+多克隆位点中，构建了follistatin的原核表达载体，并转化于大肠杆菌BL21。转化菌经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析，结果表明：试验已成功表达了follistatin的融合蛋白(约58.4 ku)。 相似文献
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试验旨在克隆猪JHDM2A基因,并研究其在猪卵巢组织中的表达情况。首先克隆猪JHDM2A基因,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体,同时对JHDM2A基因在猪卵泡发育过程中的表达情况进行分析。结果显示,克隆得到的猪JHDM2A基因编码区长度为3 945 bp,编码1 315个氨基酸。通过多重氨基酸序列比对发现,猪JHDM2A基因与黄牛、水牛、绵羊和人相应氨基酸序列的同源性分别为93.5%、94.7%、94.7%和93.8%。蛋白质分子系统进化树分析结果表明,JHDM2A基因在物种进化过程中高度保守。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体导入HEK293T细胞,可观察到清晰的绿色荧光蛋白表达。免疫组化结果显示,JHDM2A蛋白在不同发育阶段猪卵泡中均有表达。本试验通过克隆获得猪JHDM2A基因序列,JHDM2A蛋白在猪卵巢中高度表达,表明其功能可能与猪卵泡发育密切相关。 相似文献
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为了丰富广西巴马小型猪细胞因子生物学数据,本试验采取广西巴马小型猪的外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR扩增,将克隆出的与目的基因大小相符的片段回收,再与T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后提交NCBI,比较克隆序列与已知序列的同源性,并利用软件对克隆序列进行分析。结果表明,已克隆出的巴马小型猪细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α基因序列长度分别为338、377、380、402 bp,测序结果均与目的基因预期估计值吻合。序列分析结果发现与已知的家猪或野猪的相应基因同源性较高,IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α序列同源性分别为98.9%、99.5%、99.2%、100%。研究巴马小型猪细胞因子基因序列不仅丰富了生物学数据,而且为细胞因子的功能研究提供了依据,也为细胞因子的定量检测奠定了基础。 相似文献
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构建了携带绵羊朊蛋白基因（PRNP）的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞（C6）,以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。 相似文献
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广西巴马小型猪IL-4和IL-10基因的克隆和序列分析 总被引：6，自引：0，他引：6
为研究猪白细胞介素4（IL-4）和白细胞介素10（IL-10）在机体免疫应答中的作用,从ConA刺激的巴马小型猪的外周血淋巴细胞提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出IL-4和IL-10基因,将其分别克隆到PMD18-T 载体上,进行序列分析.结果表明,克隆的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列与GenBank上登录的其它猪种的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.8%～100%、97.0%～99.3%和99.2%、97.7%. 相似文献
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从猪的股二头肌中提取总RNA,利用RT-PCR技术从猪骨骼肌中获得CFL2基因的编码区序列,T-A克隆至PMD-18T载体,经HindⅢ和XhoⅠ酶切后定向克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+)中。获得的重组质粒pCDNA3.1(+)/CFL2用限制性内切酶酶切分析和DNA测序分析鉴定,并经脂质体瞬时转染C2C12细胞,最后利用PCR检测转基因细胞中CFL2基因的存在及其表达情况。结果显示:猪CFL2基因已克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)中,转染的C2C12细胞中检测到细胞内较高量CFL2的表达。pCDNA3.1(+)/CFL2真核表达载体的成功构建,为深入研究CFL2基因在猪肌肉细胞中的功能奠定基础,为猪肉质品质的改良提供了新的思路。 相似文献
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从江香猪PHKG2基因超表达载体和RNA干扰载体的构建及其表达 总被引：1，自引：1，他引：0
旨在克隆从江香猪磷酸化酶激酶γ2(phosphorylase kinase gamma 2,PHKG2)基因编码区,并对PHKG2基因功能进行初步探究。本研究利用RT-PCR法扩增从江香猪PHKG2基因完整CDS区。通过构建pEGFP-N3-PHKG2超表达载体,设计并合成4对针对从江香猪PHKG2基因的RNAi表达载体,瞬时转染至C2C12细胞株和从江香猪肾细胞中,以正常生长的细胞为空白对照,24h后检测各个重组载体的绿色荧光蛋白的表达情况。48h后提取细胞总RNA,利用qRT-PCR方法检测目的基因PHKG2和糖原代谢相关基因糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,muscle form,PYGM)、肌肉糖原合成酶(glycogen synthase 1(muscle),GYS1)、磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglyce rate mutase,PGAM2)基因mRNA的表达情况,并且测定各组细胞中的糖原含量。结果表明,经过双酶切、测序检测以及脂质体瞬时转染至C2C12细胞中,验证超表达载体pEGFP-N3-PHKG2和4对RNAi表达载体均构建成功。转染至从江香猪肾细胞后,相对于空白对照(Blank)和阴性对照(pEGFP-N3),超表达载体pEGFP-N3-PHKG2能极显著提高PHKG2基因的表达量(P0.01),同时显著上调PGAM2、PYGM基因的表达量(P0.05),并且显著降低细胞中糖原的含量(P0.05)。各RNAi载体中,相对于空白对照(Blank)和阴性对照(NC),shRNA-1的干扰效率较高,极显著下调PHKG2基因的表达量(P0.01),显著下调PGAM2、PYGM、GYS1基因的表达量(P0.05),并且显著升高细胞中糖原含量(P0.05)。shRNA-2极显著下调PHKG2基因的表达量(P0.01);shRNA-3对PHKG2基因的表达也能起到显著的干扰作用(P0.05);shRNA-4对于所检测的4个基因干扰效果不明显;shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4转染细胞后,细胞中糖原含量升高水平不明显。PHKG2基因超表达和RNAi后可分别明显上调和抑制PHKG2、PYGM、PGAM2、GYS1基因的表达,并且分别降低和提高糖原含量,可能是影响从江香猪猪肉品质的重要候选基因,为进一步研究PHKG2基因在细胞糖原代谢通路中的作用机制奠定基础。 相似文献