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为建立能同时检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的双重PCR诊断方法,该研究根据GenBank中登录的MG gapA基因序列和MS heat shock ATP-dependent protease基因序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测MG和MS的双重PCR诊断方法。特异性检测结果显示,该方法能够扩增出729 bp的MG和309 bp的MS特异性片段,对禽巴氏杆菌、大肠杆菌、鸡白痢沙门菌、副鸡禽杆菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对MG和MS DNA的最低检出量均为5×10-2 ng/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出MG、MS混合感染和单独感染。该研究建立的鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测MG和MS提供了技术支持。 相似文献
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《动物医学进展》2021,42(6)
为建立鸡毒支原体(MG)与滑液囊支原体(MS)双重PCR检测方法,一次反应即可诊断鸡毒支原体与滑液囊支原体感染情况。根据GenBank公开的MG和MS基因序列,设计了2对质粒构建引物和2对检测引物,优化检测反应体系与条件,进行灵敏性试验、特异性试验和临床检测应用。结果显示,该方法对MG和MS阳性质粒的最低检测限为10拷贝/μL;与常见的H9禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、Ⅰ群禽腺病毒4型、副鸡嗜血杆菌和鸡大肠埃希氏菌6种病原无交叉反应;应用该方法检测335份样品,MG单阳性率为7.8%,MS单阳性率为31.3%,MG和MS双阳性率为17.0%,两种支原体总的感染率为56.1%。成功建立了检测MG和MS的双重PCR检测方法,为流行病学调查和诊断提供了可靠的技术手段。 相似文献
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应用多重套式PCR检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的鸡毒和鸡滑液支原体血凝素基因序列pMGA和vlhA各设计两对引物,建立鉴别诊断两种支原体的多重套式PCR方法,对其进行温度条件、Ⅱ步模板浓度优化及特异性、敏感性实验。该方法在两步PCR后能特异性地扩增出MG(408 bp)和MS(688 bp)两个目的片段。应用于临床样品检测,与支原体分离、SPA检测比较结果PCR灵敏度高于病原分离。 相似文献
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为建立微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）定量检测鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）方法,以MG的mgpc基因序列为目的序列,在其保守区域内设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过各反应条件优化,建立了检测MG的ddPCR方法,并测定了建立方法的特异性、敏感性以及重复性。结果显示：建立方法的最佳引物浓度为20 μmol/μL,探针浓度为10 μmol/μL,退火温度为55 ℃;该方法只检出MG,没有检出鸡滑液囊支原体、禽衣阿华支原体、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽偏肺炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌,且相互间没有交叉反应;本方法最低检测MG重组质粒标准品的检测限为3.9拷贝/μL。重组质粒标准品浓度在3.9~41 025拷贝/μL范围内,绘制的ddPCR绝对定量曲线与测得值呈良好的线性关系（R2 = 0.999）;3次重复检测试验结果的变异系数均小于5%。对采集的60份病鸡喉拭子、气囊拭子及肺样品进行MG检测,结果ddPCR方法的阳性检出率（15.0%）高于荧光定量PCR方法（13.3%）。结果表明,本研究建立的ddPCR方法定量检测MG特异性强,灵敏度高,重复性好,为绝对定量检测MG提供了技术手段。 相似文献
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应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
根据鸡毒支原体 (MG)、禽衣阿华支原体 (MI)、鸡滑液囊支原体 (MS)的基因文库 ,设计了 3对分别与MG、MI、MS某段基因序列互补的引物。用这 3对引物对同一样品中的MG、MI、MSDNA模板进行多重聚合酶链式反应 (PCR)扩增 ,结果均同时得到了 3条特异性的大小与实验设计相符的 732bp (MG)、 2 99bp (MI)、 2 0 7bp (MS)多重的PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果能同时检出 1pg的MG、MI和MSDNA模板 相似文献
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本研究旨在建立一套通过添加荧光探针FD,反应后可使用成像仪直接观测结果的鉴别检测禽呼肠孤病毒(ARV)和鸡滑液囊支原体(MS)的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据ARV和MS的保守基因片段，设计了2套LAMP引物，并各添加1条FD荧光探针，2条FD探针分别标记CY5和6-FAM荧光基团。结果：ARV阳性对照在成像仪下发出红色荧光，MS阳性对照发出绿色荧光，双重模板经过图像融合后为黄色荧光；特异性结果显示，该二重荧光RT-LAMP检测方法仅能扩增ARV和MS两种病原，对其他常见病原如鸡毒支原体(MG)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)等无扩增反应；敏感性结果显示，该二重荧光RT-LAMP检测方法对ARV和MS的最低检测量分别为1.7×102 copies和1.9×102 copies;使用该方法检测40份临床样品，检出率与本实验室前期建立的二重荧光RT-PCR检测结果相同。综上，该二重荧光RT-LAMP检测方法可特异、敏感地鉴别检测ARV和MS,通过添加FD荧光探针和成像仪观测结果，为不同条件的实验室提供了新的检测手段。 相似文献
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为绝对定量滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS），试验根据已发表的MS VlhA基因序列，针对其保守区域分别设计了1对特异引物和1条探针，建立了ddPCR定量检测MS的方法，并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示：建立的方法最佳引物浓度为20μmol/μL，最佳探针浓度为10μmol/μL，最佳退火温度为54℃；该方法仅检测出MS毒株，不能检测出其他禽源病原，MS重组质粒标准品最低检测限为3.5拷贝/μL,3个连续稀释的MS重组质粒DNA检测的变异系数均小于5%;45份病鸡喉拭子、肺脏及关节囊样品检测结果显示，该方法的MS阳性检出率（11.1%）高于荧光定量PCR(8.9%)。结果表明，建立的ddPCR方法定量检测MS特异性强、敏感性高、重复性好，为绝对定量MS提供了适合的技术手段。 相似文献
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《动物医学进展》2020,(6)
为建立一种能同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的双重PCR方法,根据MG gapA基因和MS vlhA基因设计合成特异性引物,通过对双重PCR扩增条件的优化,建立能够同时检测MG和MS的双重PCR方法。结果显示,双重PCR反应条件中最适退火温度为58℃,反应体系中最适模板浓度为5.76ng/μL,最适引物量为1.25μL(10mmol/L)。特异性试验显示,所建PCR方法对MG、MS、MG/MS混合培养物均可扩增出相应的特异性条带,而对AIV疫苗、NDV疫苗、MO、E.coli、SE的基因组扩增结果均为阴性;敏感性试验显示,该方法对MS、MG最低检出核酸终浓度分别为0.045ng/μL和0.09ng/μL;临床应用性试验显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出MG和MS核酸。结果表明,该双重PCR具有良好的特异性、敏感性、临床应用性,可以用于临床病料中MG和MS的快速检测,为MG和MS感染的诊断和流行病学监测提供了一种简便适用的方法。 相似文献
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研究根据基因库中鸡毒支原体(MG)S6毒株和F株的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的二重荧光定量PCR检测方法,与其它禽类呼吸道病原体无交叉反应,对MG模板的灵敏度检测限为10拷贝/μL,对MG强弱毒模板以不同的浓度进行组合,仍可有效地检测到毒株,批内和批间重复变异系数小,特异性强、灵敏度高、稳定性好。研究建立的二重荧光定量PCR方法可用于MG强、弱毒株的鉴别检测,为该病的防控与净化提供良好工具。 相似文献
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为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和TaqMan探针,建立鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit, CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R2=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。 相似文献
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为建立快速检测猪鼻支原体(M.hyorhinis)的荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的p37基因序列设计并合成引物及MGB探针,构建含有p37基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性.结果显示该方法具有良好的特异性,与猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体、鸡毒支原体、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒、猪瘟病毒及猪流感病毒无交叉反应,对M.hyorhinis的检测敏感性为10拷贝/μL,并且稳定性好,变异系数小于2％.利用建立的荧光定量PCR方法对55份临床样品进行检测,阳性检出率为87.3％(48/55),而分离培养方法和普通PCR的阳性检出率分别为41.8％(23/55)和29.1％ (16/55).该结果表明,建立的方法特异性强、敏感性高、稳定性好,可以用于M.hyorhinis临床样品的检测,对M.hyorhinis的快速和定量检测具有重要意义. 相似文献
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根据禽呼肠病毒σC和鸡滑液囊支原体vlhA基因的保守序列,分别设计了特异性引物和不同荧光基团标记的TaqMan探针,优化反应条件,建立能同时鉴别诊断鸡滑液囊支原体和禽呼肠病毒(ARV)的检测方法。结果表明,该方法能够特异地鉴别检测ARV和MS,与其他病原体无交叉反应,检测敏感性均可达到2×10拷贝数。此外,该方法抗干扰能力强,具有良好而稳定的准确性,临床样品检出率与传统检测方法相符。因此,该基于TaqMan探针建立的荧光定量PCR具有特异、灵敏、准确、实时、重复性好等优点,不仅可用于鸡群中这两种病原体的鉴别检测和疫病监测,也有利于这两种病原体感染的有效防控。 相似文献
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支原体感染是引起鸡和火鸡多种疾病的重要因素。鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)是鸡和火鸡呼吸道疾病的重要病原。常伴发跛脚(关节炎和滑膜炎)、共济失调(大脑和皮层的实质性坏死和脉管炎)和眼部病变。鸡毒支原体感染通常被命名为鸡慢性呼吸道病和火鸡传染性窦炎,其特征为呼吸啰音、咳嗽和鼻漏。火鸡支 相似文献
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从河南某肉种鸡场疑似鸡滑液囊支原体感染的病鸡跗关节样品进行病原的分离与鉴定.分离菌经瑞氏染色,在油镜下呈球形或椭圆形.在固体培养基上表现为细小、光滑、致密的小菌落,菌落形态为“煎蛋状”.L型细菌鉴定发现菌体仍保持原有形态.菌体能够吸附红细胞,分解葡萄糖,但不能分解精氨酸和尿素,还可致SPF鸡胚死亡,说明该分离菌为支原体.进一步的血清学试验结果表明,该分离菌为鸡滑液囊支原体,而不是鸡毒支原体.根据已发表的鸡滑液囊支原体血凝素基因序列vlhA设计合成一对引物,经PCR扩增,该菌体能够扩增出鸡滑液囊支原体(773 bp)的特异性片段.人工感染试验结果显示,SPF鸡能够复制出自然病例. 相似文献
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为了解北京市鸡毒支原体(Mycoplasma galliscepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染情况,2019年从北京市10个区127个养鸡场(户),采集3 910份鸡血清样品,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行MG和MS感染抗体检测。结果显示:北京市10个区均有不同程度的MG和MS感染,场群阳性率分别介于78.95%～100%、68.42%～100%,样品阳性率分别介于59.35%～93.13%、50.0%～94.53%,平均场群阳性率分别为89.0%和86.6%,平均样品阳性率分别为79.0%和75.6%;第三季度的场群阳性率和第二季度的样品阳性率最高,第四季度场群阳性率和样品阳性率最低(P0.01);110～180日龄的MG样品阳性率、251～320日龄的MS样品阳性率最高,462日龄以上均最低(P0.01);规模化商品鸡场的MG和MS场群阳性率和样品阳性率均最高(P0.01);蛋鸡的MG和MS样品阳性率均高于肉鸡(P0.01)。结果表明,北京市MG和MS感染较为严重,第二、三季度高发,110～320日龄鸡群、规模化商品鸡场和蛋鸡群感染尤其严重。结果提示,应采取包括加强生物安全管理、种鸡净化、疫苗预防和药物治疗在内的综合管理措施,有效控制该地区MG、MS的流行。 相似文献
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为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高103～104倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。 相似文献