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1.
【目的】调查猪圆环病毒 2 型（PCV2）在云南猪群和牛群中的流行情况,明确云南 PCV2 毒株的遗传变异、分子进化趋势。【方法】采用 PCR 方法对云南省 11 个地区 783 份猪、牛的血液、粪便等样品进行PCV2 病原学检测,对 6 份 PCV2 阳性样品进行全基因组扩增、克隆与序列测定,利用 DNAStar 软件比对分析全基因和 ORF2 氨基酸序列,使用 MEGA 软件绘制遗传进化树。【结果】检测样品的 PCV2 阳性率为 48.73%;共测得 6 株 PCV2 全基因组序列,其中 5 株为 1 767 bp, 1 株为 1 768 bp;经遗传发育分析可知,有 PCV2a 亚型 2 株、PCV2b 亚型 2 株、PCV2d 亚型 2 株;6 株 PCV2 毒株同源性在 94.6%~99.9% 之间,与 GenBank 数据库中 20 条参考株同源性在 91.4%~99.8% 之间;6 株 PCV2 亚型的 ORF2 都有其典型的氨基酸位点,PCV2a 毒株在第 80（V80L）氨基酸位点突变为与 PCV2（b/d）一致,PCV2b 毒株在 59（R59K）、63（K63R）、190（A190T）等氨基酸位点突变与 PCV2d 一致。【结论】PCV2 在云南猪群中普遍存在,以 PCV2a、PCV2b 和 PCV2d 这 3 个基因亚型共存为主,且 PCV2（a/b）有向 PCV2d 突变的趋势,荷斯坦奶牛尚未感染 PCV2。 相似文献
2.
【目的】分析我国东南地区2012－2018年规模化猪场猪圆环病毒2型（PCV2）的流行动态、基因组特性及病毒重组情况,为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的防控和疫苗开发提供理论依据。【方法】对2012-2018年采自福建、江西、广东、江苏及浙江等省规模化猪场疑似断奶仔猪多系统衰弱综合症（PMWS）猪只的649份组织样本及血清样本采用PCR方法进行检测,对PCV2进行基因分型,并选取54份阳性样品进行PCV2全基因组同源性比对、系统发育分析和重组分析,同时对ORF2基因进行遗传进化分析和衣壳（Cap）蛋白氨基酸序列比对。【结果】东南地区猪场感染PCV2较普遍,PCV2阳性率为41.9%（272/649）。猪场存在PCV2a、PCV2b、PCV2d和PCV2e 4个基因型毒株,其中以PCV2d流行为主。基于PCV2全长核苷酸序列和ORF2基因的系统进化分析表明,54株PCV2毒株均分为4个基因型; PCV2e毒株检出率较低（仅为0.46%）,其基因组全长1 777 bp,与其他基因型代表毒株的全长核苷酸同源性较低（91.0%~93.0%）。重组分析表明,不同基因型毒株间存在重组现象。Cap蛋白的氨基酸序列分析表明,不同基因型具有特征性的突变位点。【结论】东南地区猪场存在4种基因型PCV2,其中PCV2d为优势基因型,不同基因型毒株间存在重组现象。新基因型PCV2e的检出率较低。 相似文献
3.
利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达PCV2b亚型ORF2基因,利用重组Cap蛋白制备PCV2 VLP疫苗的可行性。【方法】 根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2 NJ株ORF2基因,将其插入原核表达载体pQZ1,鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21,利用原核表达平台CVC1102对重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析;利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装;利用BCA试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量,利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比,得出目的蛋白量,将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg·mL-1。使用不同剂量的重组蛋白与206佐剂乳化,免疫2-3周龄抗原抗体双阴性的仔猪,同时设含免疫增强剂CVC1301、CVC1302的试验组、同类制品免疫对照组与空白对照组,免疫后14 d与21 d所有试验猪采血,分离血清,利用武汉科前生物科技有限公司的猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒检测试验猪血清中PCV2抗体水平;免疫后28 d试验猪按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2攻毒程序,利用PCV2 NJ株F6代进行强毒攻击试验,肌肉注射与口服PCV2 NJ株各105.0TCID50,同时利用乳化的钥匙孔血蓝蛋白及硫酸巯基乙醇培养基进行免疫刺激,攻毒后25 d,对所有试验猪进行解剖检测,通过攻毒过程中试验猪体温变化、试验猪平均相对日增重、解剖时试验猪肺部与相关淋巴结的大体变化及攻毒后PCV2核酸检测等4个方面评价大肠杆菌表达制备的PCV2 VLP的免疫效力。【结果】SDS-PAGE结果表明PCV2 NJ株优化的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中;Western blotting分析结果显示表达的重组Cap蛋白能够与PCV2阳性血清发生反应;电镜下观察可见大量直径在17 nm左右的PCV2病毒样颗粒存在于超声破碎后的上清中;500 μg/头重组VLP疫苗免疫猪产生较高的抗体水平,单次免疫后21 d抗体100%达到合格,对PCV2强毒的攻击提供完全保护。【结论】实现了PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达,重组Cap蛋白体外自我组装成病毒样颗粒,且具有良好的免疫原性,可用于制备PCV2亚单位疫苗。 相似文献
4.
【目的】了解广西各地当前流行的猪圆环病毒2型（PCV2）基因型差异、出现的时间、致病性及其今后流行趋势。【方法】根据GenBank中已发表的PCV2核苷酸全序列设计1对引物,从广西不同市（县）采集的猪组织样本（脾脏、肺脏、淋巴结、流产胎儿）中成功克隆获得34株PCV2 ORF2基因序列,并对其进行遗传进化分析。【结果】获得的34株PCV2中有9株ORF2基因全长为705bp,1株为696bp,其余的为702bp;经遗传进化分析,发现PCV2可以分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e5个基因型,在34株PCV2ORF2基因中,有7株属于PCV2d型,1株属于PCV2e型,25株属于PCV2b型,未发现PCV2a和PCV2c型,而新发现的GXHP-2不归属于任何一个基因型。【结论】广西目前流行的PCV2有PCV2b、PCV2d、PCV2e3个基因型,其中以PCV2b为主。 相似文献
5.
为了解猪圆环病毒2型贵州株(PCV2-GZ)ORF1基因的生物学特性,针对ORF1基因设计1对特异性引物,取PCV2阳性病料DNA为模板进行PCR扩增,克隆测序后进行生物信息学分析。结果表明:PCV2-GZ ORF1基因序列与GenBank登录的14株PCV2(06-06274,CC1,HUB-5,HUN-11,JX-1,LN-3,P710-1,PCV2HERD D,SC-10,SVP-321,SX-1,VOS 2689006,ZJ-38,N1)相应序列核苷酸的同源性为96.8%~99.7%,与国内HUB-5和ZJ-38的同源性最高,均为99.7%;PCV2-GZ编码的Rep蛋白与P710-1、HUB-5、SC-10、ZJ-38株的氨基酸序列同源性较高,均为99.4%。PCV2-GZ Rep蛋白可形成优势抗原表位,且不存在跨膜结构和信号肽,推测可进行PCV2 ORF1基因的全基因表达。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株ORF5和Nsp2基因的序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
根据美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)基因组序列设计2对引物,对疑似PRRSV感染猪的病料进行RT-PCR检测,核酸检测阳性病料进行PRRSV分离,获得了1株美洲型PRRSV,命名为GD08-2.对PRRSV GD08-2株、GD-XH株、GD08-1株的ORF5基因和部分Nsp2基因进行序列测定与分析.结果表明,GD08-2株的ORF5基因与PRRSV疫苗株pMLV、经典株VR-2332和GD-XH株的相似性较高,而与GD08-1株的相似性较低.GD08-2株的Nsp2基因推导的氨基酸序列出现12个氨基酸的不连续缺失,分别位于66~74位和192~194位,由此推测,GD08-2株可能为PRRSV的突变株.GD08-1株的ORF5基因与国内分离的高致病性PRRSV相似性较高,其Nsp2基因推导的氨基酸序列存在30个氨基酸的缺失,与国内高致病性PRRSV分离株JXA1的缺失位置完全一致,由此推测,GD08-1株属于高致病性PRRSV;GD-XH株的ORF5基因与疫苗株pMLV的相似性较高,其Nsp2基因存在个别核苷酸的点缺失.遗传进化分析表明,GD08-1株与国内分离的高致病性PRRSV的遗传进化关系较近,属同一分支;GD-XH株和GD08-2株与PRRSV经典株VR-2332、疫苗株pMLV的遗传关系较近,属另一分支. 相似文献
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【目的】了解2007-2009年部分猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株的遗传演化规律。【方法】按常规方法,从2007-2009年收集的疑似蓝耳病猪群组织样品中分离PRRSV,应用RT-PCR方法,对分离的10株PRRSV的ORF5和Nsp2基因进行扩增,测序后与19个PRRSV参考毒株的ORF5、Nsp2基因进行核苷酸、氨基酸序列比较及遗传进化分析。【结果】分离到的SDWF5、SDCX1、LN3、LN8、LN12、SD2、SD5、SD14、ZB1、ZB2共10株PRRSV均属于美洲型PRRSV变异株,其ORF5基因全长均为603bp,编码约200个氨基酸,其推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;SDWF5、SDCX1、LN3、LN12、SD2、SD5、SD14、ZB2等8个分离株的Nsp2基因全长为2845bp,编码950个氨基酸,与代表毒株VR-2332相比,8个分离株在Nsp2基因推导氨基酸序列的480和532～560位发生了不连续的30个氨基酸缺失。与19个PRRSV参考毒株的ORF5、Nsp2序列进行比较后发现,10个分离株的ORF5、Nsp2基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列均发生了较大变异。遗传进化分析发现,10个分离株与以CH-1a为代表的国内流行毒株处于同一分支,与JXA1等变异毒株的遗传距离较近。【结论】来源于不同猪群的10个PRRSV分离株的遗传关系存在交叉,没有明显的地域特征,但可能具有相同的始祖Ch-1a。 相似文献
8.
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus virus type 2,PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）以及其他猪相关疾病的主要病原体。复制酶（Replicase,Rep）蛋白是由PCV2 ORF1基因编码的功能性复制启动蛋白，通过与ORF1编码的另一复制相关蛋白Rep′共同作用参与PCV2的DNA滚环复制。Rep蛋白作为PCV2的一种必需功能性蛋白，是研究PCV2抗病毒治疗的一个新突破口。然而，目前有关PCV2致病机理及疫苗的研究大多集中在Cap蛋白，对于Rep蛋白的作用机制研究较少。因此，本文结合国内外近年研究进展，对PCV2 Rep蛋白的胞内互作蛋白进行了系统分析，尤其对现今已发现的8种胞内互作蛋白在PCV2复制过程中可能发挥的重要作用及机制进行了阐释，并对其他可能与PCV2 Rep蛋白存在相互作用的胞内蛋白进行预测，以期为进一步阐明Rep蛋白在PCV2致病中的作用提供理论依据。 相似文献
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【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。 相似文献
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【目的】了解目前四川省猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学特征和遗传变异情况,探讨PCV2感染的控制对策。【方法】根据GenBank中发表的PCV2基因组序列设计2对特异性引物,对2012-2014年临床送检的PCV2感染病例材料中的5株PCV2全基因组序列进行扩增测序,并利用DNAStar等生物信息分析软件对获得的PCV2基因组序列进行分子特性与遗传演变分析。【结果】5株PCV2四川株全基因组序列长度都为1 767bp,均具有滚环复制起点(ORC)典型结构。序列比对和进化分析显示,5株PCV2四川株的基因序列同源性很高,基因组核苷酸序列及ORF1、ORF2和ORF3基因序列同源性分别为98.4%~99.9%,97.5%~99.6%,99.4%~100%和96.2%~100%,ORF1、ORF2和ORF3基因推导氨基酸序列同源性分别为98.4%~99%,99.6%和91.5%~100%;与47条参比PCV2毒株核苷酸序列的同源性比较发现,5株PCV2与国内一些新出现的PCV2毒株亲缘关系较近,且均属于PCV2d基因型毒株。【结论】5株PCV2四川株之间尽管存在着不同程度的基因变异,但遗传进化相对较稳定。 相似文献
11.
根据 GenBank 中的猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因序列,设计合成 2 对引物,通过对环介导等温,LAMP 扩
增条件的优化袁敏感性、特异性试验,成功建立了猪圆环病毒 2 型 LAMP 诊断方法。 敏感性结果显示,建立的 LAMP
诊断方法最低核酸检测量为 0.30 pg/L袁而 PCR 诊断方法最低核酸检测量为 30 pg/L曰特异性结果显示,猪圆环病毒 1
型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。 对 95 份自然感染病猪样
品的检测结果表明,该 LAMP 方法检测结果与 PCR 检测结果符合率为 95.8%。 整个扩增反应可在 30 min 内完成,结
果肉眼可见,为猪圆环病毒 2 型的现场快速诊断提供了一种简便可行的方法,能够满足基层现场快速检疫的需要。 相似文献
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[目的]为了研究PCV2-ORF2基因片段在大肠杆菌中的表达与纯化。[方法]用PCR方法扩增PCV2 ORF2基因3′端片段,PCR产物经酶切后与经同样处理过的pET32a质粒连接,构建重组质粒。重组质粒经PCR和酶切鉴定并测序后,转化BL21感受态细胞;重组菌液用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。[结果]ORF2基因在大肠杆菌中正确表达,表达的融合蛋白的分子量约为33 ku;在37℃、1 mmol/L浓度下,诱导时间为6 h时表达量最大,占细菌总蛋白的23.62%。表达产物主要以包涵体的形式存在,将包涵体溶解后过Ni-NTA柱纯化可得到较为纯净的目的蛋白。[结论]该研究为猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)和猪皮炎和肾病综合征(PDNS)等疾病的防治奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达 总被引：2，自引：2，他引：0
猪圆环病毒是引起猪多系统衰竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,并将扩增片段定向插入质粒载体pPRO-HTb,转化BL21大肠杆菌后,构建了表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组原核表达系统。经IPTG诱导,对表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体中,通过提取包涵体,获得了初步纯化的ORF2蛋白,为进一步利用PCV2ORF2蛋白抗原进行PCV血清学检测提供了基础。 相似文献
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[目的]研究猪圆环病毒2型ORF2的基因克隆及其在E.coli中的融合表达。[方法]参照猪圆环病毒2型ORF2序列设计引物,应用PCR技术扩增出猪Ⅱ型圆环病毒河南株ORF2的部分基因。将其同IL-2的全基因一起连接PBV220载体并转化到E.coliJM109。阳性菌用温度诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析。[结果]结果表明,ORF2基因同IL-2的全基因在E.coli中得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量为44 kD,可以被猪PCV2阳性血清特异性识别。[结论]该研究为PCV2的检测和疫苗的研制以及综合防制奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒2型厦门株-1的ORF2基因序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,设计合成1对引物,对PCV2厦门株-1(XM-1)的ORF2基因进行PCR扩增.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,可清晰看见1条与设计相符的大小为729 bp的特异条带.提取该片段进行测序,并与国内外24株PCV2毒株的ORF2进行比较,发现得到的PCV2 XM-1的ORF2与广西PCV2分离株(AY556475)核苷酸和氨基酸序列同源性均达到100%,与其它PCV2毒株ORF2的同源性分别为91.6%-99.9%和88.9%-100%,表明厦门地区生猪已感染PCV2,PCV2的ORF2基因与其它毒株有所不同. 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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利用ArrayDesigner2.0软件设计PCV2引物直接从PDNS病料肺组织中PCR扩增获得PCVCQB7基因片段,用pMD18-T载体连接、克隆获得PCVCQB7重组质粒。序列测定和与标准毒株对位比对分析PCVCQB7核苷酸序列全长624bp,系PCV2ORF2基因片段,与PCV2分离株的核苷酸序列相似性在80%以上,与PCV1在66%以下,采用最大似然法构建的系统发生树分析发现PCVCQB7位于PCV2主枝上,并与国内和欧洲分离株Imp.1147、304、375、QD、GD-TS、SH、24657_NL毒株亲缘关系较近形成一小分枝,表明PCVCQB7为引起PDNS的PCV2扩增产物。 相似文献
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白介素2基因与猪圆环病毒2型ORF_2基因真核双表达质粒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2) 的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA) 等方法验证基因的表达情况.结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基凶的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2. 相似文献
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参考GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)基因的全序列,利用反向PCR技术设计一对特异引物,用PCR方法扩增从本室分离的猪圆环病毒2型GX-FSH株全基因,另设一对引物扩增编码ORF2完整基因,将它们分别连接到pMD 18-T载体,筛选获得重组阳性质粒并对其测序分析。结果表明,所克隆的GX-FSH株全基因序列与Gen-Bank上已发表的部分PCV2毒株全基因序列同源性在94.6%~99.4%之间;相应ORF2开放阅读框的核苷酸同源性在90.0%~99.1%之间,氨基酸序列同源性为90.1%~98.7%;利用生物学软件对ORF2蛋白质结构特征分析,结果提示其成熟蛋白二级结构为β类结构。 相似文献