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采用双抗体夹心ELISA方法和PCR技术对来自山东泰安的病猪组织病料进行猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)检测。将检测为阳性的病料悬液接种无PCV1污染的PK-15细胞进行病毒分离,获得一株PCV2,命名为猪Ⅱ型圆环病毒山东泰安株(PCV2 sdt)。间接免疫荧光试验(IFA)检测可见接种病毒细胞中散在特异性荧光。提取全基因组为模板,进行病毒基因组1号开放阅读框(ORF1)、2号开放阅读框(ORF2)和全基因组序列扩增,得到长度分别约为999bp、749bp和1767bp左右的产物条带。将产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-ORF1、pMD18-T-ORF2和pMD18-T-PCV2。测序结果显示,所分离病毒的ORF1、ORF2和全基因组序列长度分别为945bp、702bp和1767bp。DNAStar生物学软件分析发现,PCV2分离毒株与参考株的全基因组同源性介于95.4%~98.8%之间,ORF1的同源性介于97.0%~98.8%,ORF2的同源性略低,介于91.9%~98.4%之间。 相似文献
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罗维 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2013,39(6):626-630
对湖南各地区送检猪病料进行了猪圆环病毒(PCV)的PCR检测，并对PCV阳性病料的DNA进行了猪圆环病毒1(PCV1)与PCV2的PCR分型检测。结果表明：送检的192份样品中，有117份为PCV阳性；117份PCV阳性样品全部含有PCV2的DNA，其中2份既有PCV2也有PCV1的DNA；对病料中的PCV2进行克隆， 获得的序列均为PCV2–1基因组，对其中2株毒株的序列进行感染性克隆病毒的构建，拯救的病毒命名为PCV2(2–1)和PCV2 (4–1)；对PCV2(2–1)和PCV2 (4–1)进行培养，结果2株病毒均可以在换液维持的细胞中有效的复制。 相似文献
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【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1 767bp,与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92.6%~99.9%,2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96.0%,与PCV1核苷酸序列同源性分别为74.6%和77.7%。系统进化树分析结果显示,2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近;PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2,ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a,JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。 相似文献
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《农业科学与技术》2014,(11)
[目的]了解我国部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异特性。[方法]使用细胞传代的方法对PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料进行病毒分离,并通过PCR、IFA进行初步鉴定,并特异性扩增出该分离病毒的全基因组,并进行同源性和系统进化树分析。[结果]该研究成功分离出1株PCV2毒株,并命名为201105ZJ株;该分离株能在PK15细胞上增殖,特异性PCR检测可扩增出特异性片段,经PCV2阳性血清作用后,呈现特异性免疫荧光,其TCID50偏低,为102.67;基因组全长1768bp,与13株参考毒株的序列同源性介于94.1%~96.8%;与AF055392PCV2a的同源性最高,为96.8%;分离株201105ZJ和AF055392属于基因型PCV2a,与PCV2c基因型亲缘关系较远。[结论]该研究中201105ZJ分离株的遗传变异特征对于疫苗的研发、PCV2致病机理的研究和华东地区PCVAD的防控提供了理论依据。 相似文献
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猪圆环病毒2型吉林株的分离与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
利用猪圆环病毒2型(PCV2)特异性引物,对吉林省某猪场发生的具有典型断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)症状病猪的淋巴结、脾脏组织进行PCR检测。将检测阳性的病料研磨、高心、过滤除菌,接种到无PCV污染的PK-15细胞进行病毒分离。将PK-15细胞增殖所得的病毒纯化后,在电镜下观察到直径约为17 nm的圆形病毒样粒子。PCV2间接免疫荧光试验,可在细胞浆中观察到特异性荧光颗粒。PCV2特异性PCR检测细胞培养物,获得阳性结果。由此说明,分离出的病毒为猪圆环病毒2型。 相似文献
7.
《山东农业科学》2021,(3)
为建立猪圆环病毒1型(PCV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为现场诊断提供技术支持,本试验根据GenBank公布的PCV1全基因组序列,在其保守区设计了4条特异性LAMP引物,并通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及临床样本检测,首次建立了PCV1的LAMP检测方法。结果表明,62℃水浴60 min为最佳反应条件;LAMP的检出限为1×10~1 copies/μL,普通PCR最低检测限为1×10~3 copies/μL;对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)进行扩增,结果显示为阴性;应用该方法对103个临床疑似病料进行检测,阳性率为34.0%(35例),普通PCR阳性率为29.1%(30例),两种检测方法符合率为89.5%。本试验为PCV1临床检测提供了一种特异、快速、成本低廉的方法。 相似文献
8.
[目的]了解我国部分地区猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异特性。[方法]使用细胞传代的方法对 PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料进行病毒分离,并通过 PCR、IFA进行初步鉴定,并特异性扩增出该分离病毒的全基因组,并进行同源性和系统进化树分析。[结果]该研究成功分离出1株 PCV2毒株,并命名为201105ZJ株;该分离株能在 PK15细胞上增殖,特异性 PCR检测可扩增出特异性片段,经 PCV2阳性血清作用后,呈现特异性免疫荧光,其 TCID50偏低,为102.67;基因组全长1768bp,与13株参考毒株的序列同源性介于94.1%～96.8%;与 AF055392PCV2a的同源性最高,为96.8%;分离株201105ZJ 和AF055392属于基因型 PCV2a,与 PCV2c基因型亲缘关系较远。[结论]该研究中201105ZJ分离株的遗传变异特征对于疫苗的研发、PCV2致病机理的研究和华东地区 PCVAD的防控提供了理论依据。 相似文献
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猪圆环病毒2型的PCR快速检测及其临床应用 总被引：5，自引：0，他引：5
根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)基因组序列,设计了2段特异性核苷酸引物.通过对已知PCV2和对照病毒(PCV1、伪狂犬病毒、猪细小病毒)的PCR扩增,证明所设计的引物可用于PCV2的特异性PCR检测.采集来自江苏扬州和泰州地区的157头份临床门诊病料(每头份均为脾脏和腹股沟淋巴结双份病料)进行PCR检测,发现仅从腹股沟淋巴结检出PCV2的占21.65%,仅从脾脏检出PCV2的占7.64%,从脾脏和淋巴结均可检出PCV2的占41.40%,其中扬州市地区感染率为73.47%,泰州地区感染率为66.10%.通过对扬州某屠宰场的32份腹股沟淋巴结的检测,结果表明临床健康猪的PCV2隐性感染率也高达71.88%. 相似文献
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为分离鉴定流行于河南省的猪圆环病毒2型(PCV2),对河南省不同地区猪场的11份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪的病料进行分离鉴定,得到PCV2毒株。通过PCR检测,11份临床疑似病料中,7份确诊为PCV2阳性病料,阳性率为63.6%。挑选出阳性值较高的毒株命名为zmd-20161022,通过增殖培养筛选出优良毒株,并对其进行单层过氧化物酶试验(IPMA)鉴定,分析免疫原性;应用PCR对该病毒全基因组进行特异性扩增,经测序后对该病毒的同源性和系统进化进行分析。结果显示,该毒株序列全长1 767 bp,同源性分析发现与国内3株PCV2毒株(AY686763、HM641752、HM038034)的同源性为95.2%~98.3%,与基因登录号为HM038030.1的同源性高达98.6%。系统进化树分析发现,zmd-20161022毒株与基因登录号为HM038030.1的亲缘关系很近,被鉴定为PCV2b-1c型,属于PCV2b的一种亚型。 相似文献
11.
猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达 总被引：2，自引：2，他引：0
猪圆环病毒是引起猪多系统衰竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,并将扩增片段定向插入质粒载体pPRO-HTb,转化BL21大肠杆菌后,构建了表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组原核表达系统。经IPTG诱导,对表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体中,通过提取包涵体,获得了初步纯化的ORF2蛋白,为进一步利用PCV2ORF2蛋白抗原进行PCV血清学检测提供了基础。 相似文献
12.
为建立同时检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)2种病毒的多重PCR,设计2对PRV和PCV2特异性引物,建立同时检测这2种病毒的二重PCR方法,并对采自呼吸障碍病猪的病料进行检测。结果表明,PRV和PCV2扩增产物分别为359bp和482bp,最小DNA质量分别是2.7pg和4.3pg。采自河南省的80份样品的总阳性率为85%(68/80),其中PRV和PCV2阳性率分别为28.8%(23/80)和77.5%(62/80),混合感染率达25%(17/68)。该多重PCR检测方法敏感、特异、快速,可用于临床样品PRV和PCV2检测。 相似文献
13.
参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断. 相似文献
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【目的】建立同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的环介导间接PCR方法,实现3种病毒快速检测。【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核苷酸序列设计3对特异性探针,利用PCR技术分别标记于大豆Lectin基因片段的两端形成3种不同的报告基因,此标记的报告基因与3种待测靶标基因经杂交、缺口补平、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法,扩增片段大小分别为564 bp、434 bp和338 bp,该方法即可用于单病毒检测又可用于多病毒检测。【结果】灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单病毒检测还是多病毒检测,该法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒同时检测的底限分别为0.8、25和6.2 pg•μL-1,和单个病毒的检测灵敏度相同。利用环介导间接PCR和常规PCR对20份临床样本进行比较检测,结果表明,无论单病毒检测还是多病毒检测,其结果均与常规PCR检测结果完全一致。【结论】环介导间接PCR检测技术可用于PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒的同时检测,是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具。 相似文献
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Huan-cheng GUO Zhao-wen REN Mei-ming DING Wan-jun XIAO Peng PENG Biao HE Ye FENG Yan LIU Xing-yu LI Jian-qiu CAI Bi-kai ZHANG Qing-hua LUO Chang-chun TU 《农业科学学报》2019,18(9):2133-2140
Hybrid wild boar husbandry is an important component of livestock production in Northeast China. However, the current disease situation of these animals is largely unknown due to a lack of disease surveillance. The present study was conducted to determine the prevalence of several important viral diseases in the hybrid wild boar population of Northeast China. Between September 2015 to December 2016, 169 blood and 61 tissue samples were collected from apparently healthy hybrid wild boars from farms in Jilin, Inner Mongolia and Heilongjiang provinces. ELISA detected serum antibodies against classical swine fever virus(CSFV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV), pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type 2(PCV2) and Japanese encephalitis virus(JEV), but not against African swine fever virus(ASFV), with PCV2 having the highest seropositive rate(87.2–100% in different farms). RT-PCR or PCR performed on the processed samples detected only PCV2, with 33.1%(56/169) of blood samples and 32.8%(20/61) of spleen samples being positive, respectively, indicating widespread PCV2 infection in hybrid wild boars. Phylogenetic analysis of 15 PCV2 ORF2 sequences showed that they belong to genotypes PCV2a, PCV2b and PCV2d, with nucleotide and deduced amino acid homologies of 88.5–100% and 88.1–100%, respectively. 相似文献
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猪Ⅱ型圆环病毒-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建(初报) 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank发表的PCV2序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2 ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到了表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215(C)。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪Ⅱ型圆环病毒和伪狂犬病毒候选疫苗毒株。 相似文献
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[目的]明确猪圆环病毒3型(Porcine circovirustype 3,PCV3)在广西猪群中的致病性及流行病学特点,为有效防控其暴发流行提供参考依据.[方法]采用PCR对广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品进行PCV3检测,并对其唯一结构蛋白质(Cap)的结构进行同源模拟,构建遗传进化树;同时在线(http://www.cbs.dtu.dk/services/)预测Cap蛋白信号肽、糖基化位点和B细胞抗原表位.[结果]在广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品中检测到PCV3.PCR扩增产物经核苷酸序列测定分析后截取Cap基因序列(645 bp),命名为PCV3/CN/Guangxi001/2017.PCV3/CN/Guangxi001/2017与13株国内PCV3毒株和5株美国PCV3毒株的Cap基因序列同源性分别在96.9%~99.4%和98.3%~99.5%,属于3b亚群;而与PCV1毒株和PCV2毒株的核苷酸序列同源性只有43.0%和45.8%,且B细胞抗原表位差异明显,在PCV1特有的B细胞抗原表位(92~103 aa)、PCV2特有的B细胞抗原表位(69~83 aa、117~131 aa和231~233 aa)及PCV1、PCV2共有的B细胞抗原表位(156~162 aa和179~192 aa)均无相似性.[结论]广西猪群中已存在PCV3感染,鉴于PCV2与PCV3间无交叉免疫保护特性,实际生产中应通过加强清洁消毒、灭鼠杀虫、定期监测、自繁自养等生物安全措施防控PCV3暴发流行. 相似文献