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1.
根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列，设计合成了1对特异性引物，以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板，利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因（1035bp），将其克隆到pET-32a（＋）载体上，构建了原核表达载体pET—HA，表达并纯化了重组蛋白，通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示，表达并纯化的Hpg HA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合，并且可以凝集鸡红细胞。表明，成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体，并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg—HA融合蛋白。 相似文献
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鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗诱导免疫保护的实验研究 总被引：3，自引：0，他引：3
实验分别将应用Bac to Bac系统表达的新城疫病毒四平株和长春株血凝素-神经氨酸酶基因（HN基因）蛋白的重组杆状病毒感染Sf-9昆虫细胞后28℃培养72h后，洗涤、收集昆虫细胞，离心浓缩，-20℃冻融3次，用HA-HI实验和HN单抗中和试验测定表达产物的活性，将表达的重组蛋白作为亚单位疫苗免疫鸡，用间接ELISA和HI试验测定鸡体内抗体效价，免疫后第15d用国家标准强毒NDVF48E8攻毒，统计免疫保护率，结果表明，表达的NDVHN重组蛋白能够诱导鸡体产生抗NDV特异性IgG抗体和HI抗体，实验Ⅰ组（四平株）雏鸡保护率为65%，实验Ⅱ组（长春株）雏鸡保护率为100%。 相似文献
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以牛分枝杆菌Vallee株基因组为模板，利用PCR方法扩增该菌株的环丙烷一分枝茵酸合酶pcaA基因，并克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中，通过大肠杆菌BL21（DE3）表达重组融合蛋白，并利用Ni-亲和层析的方法纯化出重组蛋白。通过鉴定其免疫活性。试验结果表明，成功扩增出了牛分枝杆菌中pcaA基因并纯化出了重组的融合蛋白，通过免疫印记发现，重组蛋白可与牛结核阳性血清发生特异性反应，为进一步研究牛分枝杆菌的致病机理奠定基础。 相似文献
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从pMD18-T—HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒（AIV）HA1基因，并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A，将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1，与线性化杆状病毒DNA（Bac—N—BlueDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3次蚀斑纯化，得到重组杆状病毒rpBlue-HisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示，HA1在昆虫细胞中得到表达，且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明，重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明，重组HA1蛋白具有良好的血凝性。 相似文献
6.
为原核表达弓形虫的TgERP基因，参照GenBank中弓形虫GTl株的TgERP基因序列设计引物，通过PCR扩增分离的一株猫源弓形虫（TC株）的TgERP基因，将其克隆至原核表达载体pET-28a中，通过IPTG诱导表达蛋白，应用带His标签的重力柱纯化蛋白，采用BCA方法测定蛋白浓度，利用重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体，并对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果成功表达了TgERP蛋白，且蛋白以上清形式表达，相对分子质量约16 ku。将纯化的重组蛋白pET-28-TgERP作为诊断抗原，初步建立了间接ELISA方法；利用间接ELISA、改良凝集试验（MAT）和间接血凝试验（IHA）3种方法分别检测472份羊、犬、猫血清样品，发现阳性率分别为1.0%、3.8%、3.4%，验证了建立的间接ELISA方法可区分动物感染弓形虫的途径。本研究为弓形虫病快速诊断方法的建立和疫苗的研发奠定了基础。 相似文献
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鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达及生物学活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
通过PCR方法扩增不含信号肽的鸡GM-CSF成熟蛋白基因,克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,构建原核表达质粒p32GM-CSF,通过IPTG诱导重组鸡GM-CSF蛋白表达,经镍离子亲和层析纯化后,用MTT法检测表达重组蛋白的生物学活性,并制备兔抗鸡GM-CSF多克隆抗体。结果表明成功地构建了p32GM-CSF原核表达质粒,SDS-PAGE结果显示表达的重组蛋白约34 ku,主要以包涵体形式表达,纯化后得到高纯度目的蛋白。West-ern Blot结果表明,该重组蛋白能与制备的抗鸡GM-CSF抗体特异性结合。MTT试验证实,该重组蛋白具有明显增强鸡骨髓细胞增殖的生物学活性;这些研究结果表明,表达的重组chGM-CSF蛋白及其多克隆抗体拥有相应的生物学功能,这将为进一步研究鸡GM-CSF蛋白的生物学功能及其应用奠定基础。 相似文献
8.
采用PCR方法从鸡源新城疫病毒（NDV）强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V基因全长cDNA，并引进相应的突变位点，将其克隆到pMD18-T载体，然后亚克隆到原核表达载体pET-30c上，重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序，筛选出阳性重组质粒，并命名为pET-30c-V。将pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21（DE3），用1mmol／LIPTG 37℃过夜诱导表达，SDS-PAGE及Western-blotting分析结果表明，所表达的NDVV重组蛋白主要以包涵体形式存在，分子质量约28ku，与理论值大小相符。将包涵体用8mol／L脲变性，经Ni-NTA柱纯化，透析复性，得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡（300μg／只），成功制备了抗鸡NDVV蛋白的抗血清。 相似文献
9.
采用RT-PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus, IBV）HH06株E基因全长,经抗原性和亲水性分析,将E基因部分序列（193～327 bp）亚克隆于pET-32a（+）和PVAX1载体中。将阳性重组质粒pET-32a-E1转化E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞,诱导表达获得大小约为23 ku的重组截短E1蛋白,Western blotting检测重组蛋白与IBV全病毒多克隆抗体能特异性反应。以纯化后的E1蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价达到220;Western blotting分析表明,E1多克隆抗体与重组表达蛋白具有良好的反应性;间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体可检测到PVAX-E1转染Hela细胞表达的E1蛋白和感染鸡胚肾细胞（CEK）中的HH06株IBV,抗E蛋白多克隆抗体的制备为E蛋白功能的深入研究奠定了基础。 相似文献
10.
对狂犬病病毒（RV）ERA株核蛋白（N）基因进行了克隆和序列分析。根据GenBank中已发表的RVN基因序列，设计合成了1对特异性引物，对RV ERA株N基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pMD18T连接得到重组质粒pMD-N，并进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1353bp，编码450个氨基酸。RV ERA株与CVS-11、PV-11、SRV9和SAD—B19株相比，核苷酸的同源性分别为98％、98．3％、99％、99.6％，推导的氨基酸的同源性分别为98％、99％、99％、99.6％。将pMD-N双酶切，回收目的基因片段并克隆到原核表达载体pET28a（＋）中，构建了重组质粒pETN；将其转化表达菌BL21（DE3）并用IPTG进行诱导表达。结果重组菌裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为53kDa的重组蛋白。经凝胶薄层扫描分析，重组蛋白表达量占菌体蛋白的56．8％，Western-blot结果显示该重组蛋白能与RV多克隆抗体发生特异性反应。 相似文献
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Serological response of chickens either vaccinated or artificially infected with Haemophilus paragallinarum 总被引：5，自引：0，他引：5
The serological response of chickens either vaccinated or artificially infected with Haemophilus paragallinarum (Hpg) serovar A or C was investigated using both a specific hemagglutinin (HA) antigen and a common HA antigen. With Hpg serovar A, both vaccinated and artificially infected chickens produced hemagglutination-inhibition (HI) antibodies to Hpg serovar-specific and Hpg common HA antigens. Most chickens vaccinated with Hpg serovar C had detectable HI antibodies to both types of HA antigen by 3 weeks postvaccination, after which titers gradually declined. In contrast, most chickens artificially infected with serovar C produced HI antibodies to only the common HA antigen; very few of these chickens produced HI antibodies to the serovar-specific HA antigen. 相似文献
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2011年11月,山东某肉鸡场发生以肉鸡眼睑及眶下窦周围明显肿胀为主要特征的传染性疾病。从采集的发病鸡眶下窦中分离到1株细菌,根据发病鸡群的临床症状、细菌的分离培养、形态观察、过氧化氢酶试验、革兰氏染色、动物回归试验、免疫攻毒试验和PCR等方法初步鉴定为副鸡嗜血杆菌(Hpg)。此外通过分离菌株的水平传播试验结果表明,造成该鸡场Hpg的水平传播和鸡传染性鼻炎的反复发作与饲养密度有很大的关系。最后将分离菌株送匈牙利诗华研发中心进行分型鉴定,确定为A型副鸡嗜血杆菌。根据分离地点将分离菌株命名为A型副鸡嗜血杆菌(山东株)。另外通过与GenBank已发表的Hpg基因序列进行同源性比对分析,结果显示,该基因序列与参考株的基因核苷酸序列同源性达99.0%。 相似文献
13.
试验旨在分离兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝（HA）和血凝抑制（HI）检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD50测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV （AV33）抗血清抑制,该毒株的LD50为10-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740 bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株（RHDVa）,与RHDV1和RHDV2 VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%~97.6%和81.1%~81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%~98.3%和87.4%~87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta （DE3）中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74 ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。 相似文献
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猪流感病毒血凝素基因原核表达及其在间接ELISA中的初步应用 总被引：3，自引：0，他引：3
利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)血凝素(HA)基因,克隆于pMD18-T载体进行测序。以pMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重组表达质粒pET-HA,将质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,HA蛋白获得了高效表达,经Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫学活性,在间接ELISA中的初步应用表明具有良好的抗原反应性。本研究为以重组HA蛋白为抗原建立H1亚型猪流感抗体的ELISA检测方法奠定了基础。 相似文献
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Expression of hemagglutinin of Haemophilus paragallinarum serotype A in Escherichia coli. 总被引：1，自引：0，他引：1
M Takagi K Ohmae N Hirayama S Ohta 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》1991,53(5):917-920
The genomic DNA of Haemophilus paragallinarum (Hpg) serotype A strain 221 was cloned into vector plasmid pBR322. The recombinant plasmids were introduced into Escherichia coli (E. coli) strain C600. Subsequently, a total of 277 transformants were obtained. One, designated strain no. 6, expressed hemagglutination activity against chicken erythrocytes. Strain no. 6 contained the recombinant plasmid pNV102, and DNA of about 2.57 kb was inserted into pNV102. When strain no. 6 was cured of pNV102, the strain lost hemagglutination activity. When the cured strain was retransformed with pNV102, hemagglutination activity was restored. E. coli strain no. 6 reacted with monoclonal antibody specific to the hemagglutinin of Hpg serotype A in a dot-blotting analysis. Chickens immunized with the inactivated strain no. 6 produced the hemagglutination inhibition (HI) antibody, and chickens possessing the HI antibody showed protection against challenge exposure by Hpg strain 221. 相似文献
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本研究从临床发病猪采集病料,以PK15传代细胞进行病毒分离,通过PCR、血液凝集试验(HA)和电镜鉴定为1株猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV),命名为BQ-C。对分离的毒株进行测序,结果显示该毒株与GenBank登录的PPV BQ株同源性为100%。为获得该毒株结构蛋白VP2基因的表达产物,将VP2基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+),得到表达重组质粒。经双酶切和测序鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE结果表明,获得的重组蛋白分子质量约为71.5 ku,与预期大小相符。Western blotting结果显示获得的重组蛋白能与PPV阳性血清特异性结合,表明重组蛋白具有良好的反应原性。结果表明,本研究成功分离了1株PPV BQ-C株,且表达的VP2重组蛋白可用于PPV血清学诊断和疫苗的研发。 相似文献
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根据GenBank已发表序列设计引物，通过RT-PCR成功获得了H9亚型禽流感病毒北京分离株A／Chicken／Beijing／1／96（H9N2）的HA1片段，经序列分析HA1片段与其他已发表序列同源性为95％～98％。将HA1片段克隆入pET．28a的多克隆位点构建重组质粒pET28-H9HA1并转化宿主菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实，H9HA1片段得到表达，并且表达的蛋白带分为42Ku和23Ku两条。血凝实验和血凝抑制实验表明原核表达的HA1蛋白不具备血凝活性，其阳性血清不能引起血凝抑制。交叉反应实验证实原核表达的重组蛋白能与禽流感病毒H9亚型单特异性血清反应，而与禽流感病毒H5、H7亚型以及其他禽传染病病原微生物单特异性血清无交叉反应。说明表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性，有开发成为H9亚型禽流感检测试剂的可能。 相似文献
18.
猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用 总被引：11，自引：3，他引：11
根据GenBank中A/Swine/Hong Kong/126/82(H3N2)株猪流感病毒(SIV)NP基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR扩增了我国SIV分离株A/Swine/Heilongjiang/3/2000(H3N2)的核蛋白(NP)基因.将扩增所得NP基因克隆于pMD18-T载体,酶切鉴定后对其序列分析表明NP基因与香港分离株同源性高达93.8%,然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有NP基因的重组质粒命名为pET-NP.用pET-NP转化受体菌BL21,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品.经SDS-PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG诱导下,6 h其表达量达到高峰,经Western blot分析证实表达的重组核蛋白具有反应活性,大小约为60kD.用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与SIV抗血清可形成清晰的反应沉淀线,而与其它9种猪病原阳性血清不发生反应.正常菌体蛋白与SIV阳性血清也不发生反应.通过对40份送检血清样品的检测结果显示其与HI试验的相符率高达95%以上.试验证明利用原核表达系统制备的重组核蛋白作为诊断用抗原,不仅制备过程简单而且所建立的琼扩诊断方法特异、快速、简便,其灵敏度也能满足现地的使用要求.目前正在进行现地的中试试验. 相似文献
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采用聚合酶链反应或反转录聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构建含这些基因的转移载体质粒pMHA;以MDV Rispens CVI988毒株的基因组DNA和PMHA质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),采用同源重组方法将LTR、lac/smGFP和HA基因插入到MDV基因组,获得重组病毒rMDV-HA/GFP;以cre介导的同源重组去除lac/smGFP标志基因,再转染CEF,获得仅带LTR启动子和HA基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-HA.rMDV-HA仍保留了MDV RispensCVI988疫苗毒株的复制特点,并能稳定表达AIV的HA. 相似文献
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禽流感病毒H5HA、H7HA基因共表达核酸疫苗质粒的构建及其在体外的表达 总被引：4，自引：0，他引：4
为了获得既能对 H5亚型又能对 H7亚型 AIV攻击产生保护的核酸疫苗 ,设计构建了含有双顺反子的真核表达载体 ,用限制性内切酶从 PCIH7HA载体上切得 AIV H7HA基因的c DNA,此 c DNA含有 CMV启动子和 Poly(A)终止序列 ,使用 DNA 连接酶引入载体PCIH5HA中 ,最后获得双顺反子真核表达载体PCI-H5HA-H7HA,其中 H5HA和 H7HA基因都带有自己的 CMV启动子和 Poly(A)终止序列。选用 2 93 -T真核表达细胞系 ,用脂质体转染法导入细胞进行瞬时表达 ,转染后 48h用荧光标记的兔抗鸡 Ig G进行间接免疫荧光试验。结果表明双顺反子真核表达载体构建正确 ,且在真核表达细胞系中 H5HA和 H7HA基因都能获得表达 ,且 H5HA 基因的表达效果优于H7HA。这为进一步的动物免疫试验和疫苗效价检测试验奠定了基础 相似文献