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对2005年四川资阳脑膜炎病例猪链球菌2型分离株ZYH33溶血素编码蛋白中包含多个抗原表位的第230～593氨基酸残基区域的基因片段进行扩增并克隆.基因片段经酶切处理后插入表达载体pQE-30的BamH Ⅰ和Sal Ⅰ位点之阃,构建融合表达质粒.转化宿主菌TG1经IPTG诱导后融合基因得到了表达,用猪链球菌2型菌体抗血清对表达的融合蛋白进行免疫印迹试验,分析融合蛋白的免疫反应性.试验结果提示该溶血素蛋白第230～593氨基酸残基区域可作为猪链球菌的诊断抗原,为基因工程疫苗的研制奠定基础. 相似文献
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鸡白细胞介素-18基因的原核表达及多克隆抗血清的制备 总被引：9，自引：0，他引：9
将编码鸡白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pPROEXTMHT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IPTG于37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在，目的蛋白表达量占菌体蛋白的30％。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-18融合蛋白相对分子质量约为23000。包涵体被6mol／L盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-18融合蛋白及其纯化产物经3次肌肉注射豚鼠，制备豚鼠抗鸡IL-18多克隆抗血清，并用琼脂扩散试验多克隆抗血清进行了证明。本试验成功的原核表达、纯化了鸡IL-18融合蛋白，并制备了抗鸡IL-18多克隆抗血清，为下一阶段关于鸡IL-18重组蛋白生物学特性及其应用的研究打下了坚实的基础。 相似文献
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【目的】构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202PA-LF1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据。【方法】根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF1基因片段,经XhoⅠ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF1融合基因片段,利用SWISS-MODEL分析软件分别对PA、LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(＋)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性。【结果】从炭疽芽孢杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF1和PA-LF1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。【结论】PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2016,(23)
为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)的优势抗原表位COE可溶性原核表达及其反应原性,试验采用RT-PCR方法扩增出COE基因,将其克隆至原核表达载体p MAL-C5X上,构建重组质粒p MAL-C5X-COE,经测序鉴定正确后转化Rosetta感受态细胞,并进行IPTG诱导表达和Westernblot验证。结果表明:重组菌p MAL-C5X-COE表达的融合蛋白MBP-COE的分子质量约为57 ku,优化的诱导条件为IPTG浓度0.8 mmol/L、诱导时间4 h,诱导温度30℃,重组蛋白以可溶性蛋白形式存在于菌体中,融合蛋白与兔抗PEDV多克隆抗血清发生特异的免疫印迹反应。说明原核表达的COE融合蛋白可溶且具有良好的反应原性。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(8):1354-1357
经BLAST分析表明,开放阅读框z3276是大肠杆菌O157∶H7独有的遗传标志性基因,编码氨基酸与大肠杆菌Ⅰ型菌毛有较高的同源性,但z3276基因编码蛋白的生物学特性尚不明确。为了明确z3276基因编码蛋白的抗原性,进一步研究其在大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用。采用PCR方法扩增z3276基因,去除其信号肽序列,克隆到原核表达载体pColdⅠ,转化感受态细胞BL21获得阳性重组菌,IPTG诱导表达重组蛋白,以大肠杆菌O157∶H7全菌抗血清为一抗,Western blot方法检测重组z3276蛋白抗原性。结果显示,成功构建重组菌BL21(pColdⅠ-z3276),并获得高效表达;相对分子质量33 000,占菌体总蛋白30%以上,主要以包涵体形式存在于菌体沉淀中;且与兔源全菌多克隆抗血清发生特异性反应,条带明显。 相似文献
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利用PCR方法从猪链球菌2型四川资阳分离株449-1扩增出sp基因,克隆到pMD18-T载体中,构建出克隆载体pMD18T-sp。以SalⅠ和BamHⅠ从pMD18T-sp中切下目的sp基因片段并克隆到质粒pMAL-p2X中,构建重组表达质粒pMALp2X-sp,转化宿主菌TB1中进行诱导表达。分析表明sp基因序列比GenBank报道序列AY864331少了270 bp;SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组菌株表达出了136 Ku左右的目的蛋白MBP-Sao,目的蛋白为可溶表达,约占菌体蛋白总量的12.3%。表达的蛋白可用Amylose树脂纯化。将纯化的融合蛋白MBP-Sao免疫家兔,所得抗血清经ELISA检测,结果显示融合蛋白MBP-Sao包板抗体效价达1:16 000,且与猪链球菌2型和9型呈阳性反应,而与沙门氏杆菌及巴氏杆菌呈阴性反应。本试验对猪链球菌2型表面蛋白Sao的高效表达及其免疫原性进行了初步研究,为进一步研究猪链球菌2型表面蛋白Sao的结构和功能奠定了基础。 相似文献
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为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)部分N蛋白的原核表达产物是否具有抗原性,并为建立PEDV的间接ELISA方法奠定基础,本试验应用RT-PCR技术扩增N基因的部分核酸序列,经克隆后将目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)中。重组菌于37 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导4 h后进行SDS-PAGE分析,并进行Western blotting鉴定。结果显示,构建的原核表达重组质粒测序正确,且该蛋白与抗血清(PEDV高免血清)具有良好的反应活性。本试验成功构建了PEDV部分N基因原核表达载体,为后续PEDV感染的血清学诊断方法的建立提供依据。 相似文献
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为制备鸡肝脏型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）的多克隆抗血清,并分析L-FABP的组织表达特性,利用RT-PCR扩增L-FABP基因,构建鸡L-FABP基因的GST融合蛋白表达质粒pGEX-4T／L-FABP。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导产生GST／L—FABP融合蛋白,用亲和层析纯化目的蛋白,将纯化的GST／L—FABP融合蛋白免疫家兔制备抗血清,并利用此抗血清分析鸡0FABP基因的组织表达特性。诱导得到了1个40ku（14ku L—FABP＋26kuGST）的融合蛋白,获得效价较高、特异性强的鸡L-FABP的抗血清。鸡L-FABP的组织表达特性研究结果表明,该基因在肝脏和小肠组织中有较高表达,但在心脏、脂肪、肌肉、肌胃、脾、肺和肾中没有检测到表达信号。 相似文献
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鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白与新城疫病毒F蛋白的融合表达及免疫原性分析 总被引：3，自引：0，他引：3
应用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因以及含有新城疫病毒F蛋白部分表位的基因片段,通过柔性肽(Gly4Ser)2编码序列将二者串联并克隆到质粒pET30a+上,获得重组原核表达质粒pET-fliC-F,将其转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。Western blot证实重组菌表达的fliC-F融合蛋白能与小鼠抗fliC和抗F蛋白两种多抗血清发生特异性反应。动物试验显示,fliC-F融合蛋白能够刺激C3H/HeJ小鼠产生针对F蛋白的特异性血清抗体,说明原核表达系统表达的fliC-F融合蛋白具有较好的免疫原性。 相似文献
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This assay was aimed to express the PuAH gene of Edwardsiella tarda (E.tarda) EIB202 and analyze its partial characteristics.A pair of specific primers was designed based on the PuAH gene sequence of E.tarda published in GenBank(accession No.:CP001135,CDS No.:ETAE_0818).The gene was cloned and expressed by recombinant plasmid pET32a-PuAH in E.coli BL21(DE3).The recombinant protein was purified and used to immune New Zealand rabbits to prepare antisera.Then the characteristics of expression product and antisera were analyzed by ELISA,Western blotting,hemolysis test and bacterial agglutination test.In conclusion,the expression product was fusion protein with 42 ku molecular weight,and had immunogenicity and antigenicity,but no hemolytic to erythrocytes of eel.Yet the antisera could inhibited the hemolytic of outer membrane protein of E.tarda EIB202 to some extent,and could agglutinate E.tarda EIB202. 相似文献
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Interferon (IFN) had recieved much more attention because of its broad-spectrum antiviral, antitumor activity and immune regulation.One pair of primers were designed for amplifying pig IFN-δ gene with PCR method according to the relevant sequence from GenBank.The IFN-δ gene was cloned into prokaryotic expression vector, and the recombinant plasmid was obtained.We transformed the recombinant plasmid into E.coli Transetta BL21(DE3) strain and the protein expression was identified by SDS-PAGE and Western blotting.The results showed that pET-30a-DsbA-IFN-δ recombinant protein was 20 ku and expressed mainly in the form of inclusion body, these expressed protein could specific react with His-tag monoclonal antibody. 相似文献
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An avian pathogenic Escherichia coli strain M1000 showed a clear zone of erythrocyte lysis on sheep blood agar plates. The hemolytic activity was not detected in the culture supernatant nor was any DNA sequence homologous to the E. coli -hemolysin gene detected in the chromosome or plasmid DNA of the strain, indicating that the observed hemolysis was different from -type. To identify the genetic determinant responsible for the hemolysis, we performed random Tn5 insertional mutagenesis and obtained one mutant, named M5005, that totally lacked the hemolytic activity. Cloning and nucleotide sequencing of the region flanking the transposon insertion site in the M5005 chromosome revealed that the transposon was inserted within an open reading frame of the cyclic AMP receptor protein (CRP) gene, which is involved in one of the global regulatory networks of gene expression in E. coli. Nucleotide sequence analysis of the intact crp gene of the strain M1000 showed that the CRP protein of M1000 is 99% identical to that of K-12. Introduction of the intact crp gene on a low copy plasmid into the mutant M5005 restored the hemolytic phenotype, confirming that the mutation site in M5005 was in the crp gene. CRP plays a central role in catabolite repression, the phenomenon by which the synthesis of many enzymes required to metabolize various sugars is repressed in the presence of glucose. When the hemolytic activity of E. coli M1000 grown in the presence of glucose was examined, the hemolysis was totally impaired. These results indicate that the avian pathogenic E. coli strain M1000 produces a hemolysin the expression of which is dependent on crp gene function. 相似文献
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干扰素(interferon,IFN)因具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节作用而备受关注。本研究根据GenBank上公布的猪IFN-δ核苷酸序列设计1对引物,通过PCR方法扩增出猪 IFN-δ基因,片段大小为513 bp,并将其克隆到原核表达载体上得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta BL21(DE3)受体菌,经SDS-PAGE电泳分析,结果表明,pET-30a-DsbA-IFN-δ表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约20 ku,且主要以包涵体形成存在,经Western blotting分析发现表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。 相似文献
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顶复门原虫的AP2结构域蛋白(ApiAP2)可能是调控虫体生长发育的转录因子。本研究旨在克隆、表达毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子，检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫第3代裂殖子的总RNA为模板，RT-PCR扩增毒害艾美耳球虫EnApiAP2基因后，连接至pMD18-T载体，测序后构建pET28a (+)-EnApiAP2表达载体，转化至表达菌BL21(DE3)，重组菌经测序鉴定后诱导表达，并纯化复性重组蛋白。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠抗rEnApiAP2多克隆抗体。利用多克隆抗体，分别用Western blot和间接免疫荧光试验检测裂殖子中天然EnApiAP2蛋白及其定位。最后，应用荧光定量PCR分析EnApiAP2基因在第2、3代裂殖子中的转录水平。结果显示，该基因全长1 830 bp，编码610个氨基酸，含有一个AP2结构域，预测分子质量67.69 ku；重组蛋白大小约为74 ku，主要以包涵体形式存在，可以被6×HIS标签单抗、鸡抗毒害艾美耳球虫康复血清和鸡抗柔嫩艾美耳球虫康复血清识别；在第3代裂殖子中检测到天然EnApiAP2蛋白，分子质量约为85 ku；EnApiAP2蛋白定位在第2、3代裂殖子细胞核内；第3代裂殖子EnApiAP2转录水平显著高于第2代裂殖子(P<0.01)。成功克隆、表达了EnApiAP2基因，证实该基因表达的蛋白定位在裂殖子的细胞核内，为进一步研究EnApiAP2蛋白的转录因子功能奠定了基础。 相似文献
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[目的] 克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15（interferon stimulating gene 15,ISG15）基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础。[方法] 提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞（baby hamster syrian kidney,BHK-21）;同时亚克隆到原核表达载体pET-28a（+）构建重组表达质粒pET-28a-ISG15,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩ISG15蛋白;重组蛋白经镍离子亲和层析法纯化并免疫小鼠,获得鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体,利用Western blotting和间接免疫荧光技术（IFA）检测其反应性。[结果] 成功克隆瑶山亚种树鼩ISG15基因,并构建了其真核和原核表达载体,真核表达载体在BHK-21细胞中能高效表达;原核表达载体在大肠杆菌中30 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h获得重组蛋白（分子质量22 ku）,蛋白以包涵体形式表达,经镍离子亲和层析法得到纯化。乳化后的重组蛋白免疫小鼠,获得抗瑶山亚种树鼩ISG15的多克隆抗体,经Western blotting检测,制备的鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体稀释度在1：8 000时仍能够与0.01 μg ISG15重组蛋白结合。IFA检测发现,多克隆抗体能与真核细胞过表达的蛋白反应,抗体反应性良好。[结论] 构建的原核表达载体在大肠杆菌中高效表达瑶山亚种树鼩ISG15蛋白,重组蛋白纯化复性后具有良好免疫原性,获得的多克隆抗体为进一步研究树鼩抗病毒感染免疫奠定了良好基础。 相似文献
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旨在探析毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1的功能。提取毒害艾美耳球虫扬州株配子体总RNA,应用RT-PCR获取EnOXIO1编码基因,构建原核表达载体pET-28a(+)-EnOXIO1,转化至大肠杆菌BL21(DE3),体外诱导表达,对重组蛋白进行抗原性分析,应用制备的多抗进行激光共聚焦免疫荧光定位。结果显示,获得的EnOXIO1基因全长为2 535 bp,体外重组表达的蛋白大小约100 ku,主要以包涵体的形式存在,表达量约为0.5 mg·mL-1。Western blot分析结果显示,该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体识别,同时能被制备的鼠多抗以及毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别,表明该重组蛋白具有较好的反应原性和交叉反应原性。激光共聚焦免疫荧光定位结果显示,EnOXIO1基因表达产物主要存在于配子体内的成壁体上,参与了卵囊壁的形成。本研究成功克隆和表达了毒害艾美耳球虫EnOXIO1蛋白,并将其定位于配子体和卵囊壁上,为进一步解析EnOXIO1蛋白参与卵囊壁形成的分子机制奠定基础,为研制新型免疫阻断型球虫亚单位疫苗提供重要靶抗原。 相似文献
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为了研究猪附红细胞体eno基因重组蛋白的免疫效果,本试验将猪附红细胞体eno基因与pET-15b载体进行连接,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。对表达菌株进行诱导表达、纯化,利用纯化后的猪附红细胞体eno重组蛋白（命名为rMseno）对小鼠进行免疫,从而评价该重组蛋白在小鼠体内产生的免疫应答水平。试验将20只4周龄的雄性昆明小鼠随机分为A、B、C、D 4个组。免疫A组接种纯化后的重组蛋白rMseno;免疫B组接种经IPTG诱导表达后的重组菌E.coli-Mseno;对照C组接种等量PBS;对照D组接种未经过诱导表达的重组菌E.coli-Mseno。通过ELISA检测方法分别测定血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平及γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）细胞因子水平,最后通过脾脏淋巴细胞增殖试验来反映小鼠体内T淋巴细胞的增殖情况。结果显示,构建的重组pET-15b-eno质粒目的基因片段大小为1 632 bp,与预期大小相同;纯化的重组蛋白rMseno大小为61 ku,并能够被鼠抗猪附红细胞体血清所识别;免疫A组和免疫B组小鼠血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平以及T淋巴细胞增殖指数均显著或极显著高于对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,猪附红细胞体eno基因重组蛋白能够诱导小鼠产生较高的体液免疫水平以及细胞免疫应答水平。 相似文献
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【目的】 利用腺病毒AdMax系统表达载体表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）,并研究其免疫原性。【方法】 参考GenBank中已公布的PRRSV N基因序列（登录号：KT945017.1）,人工合成PRRSV N基因,并将其连接至腺病毒穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建重组穿梭质粒pDC316-N。将重组穿梭质粒pDC316-N与AdMax腺病毒系统的骨架质粒PBHGLOX （delta） E1,3Cre共同转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-N,对获得的重组腺病毒液进行PCR和测序鉴定,用鉴定正确的rAd-N病毒液感染293A细胞,对该重组腺病毒进行扩大培养,检测病毒的TCID50,并用RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的表达和反应原性。用重组腺病毒免疫小鼠,收集血清用PRRSV抗体检测试剂盒检测其抗体水平,初步评价其对小鼠的免疫效果。【结果】 PCR扩增出1条大小为400 bp的PRRSV N基因条带,测序结果正确,表明重组腺病毒构建成功,浓缩后测得其半数组织培养感染剂量（TCID50）为10-10.239。RT-PCR和Western blotting检测结果证实目的基因在基因和蛋白水平上均可得到正确表达,蛋白分子质量约为14 ku。小鼠特异性抗体检测表明,重组腺病毒rAd-N免疫小鼠后可使小鼠快速产生PRRSV特异性抗体,与对照组差异显著（P<0.05）,其中重组腺病毒与Gel佐剂配合使用时效果最好,最高可达7.84 U/L。【结论】 本研究成功构建表达PRRSV N蛋白的重组腺病毒,其具有良好的免疫原性,为建立针对PRRSV抗体的间接ELISA检测方法和进一步研发PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。 相似文献