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1.
【目的】克隆中国野生毛葡萄"商-24"天冬氨酸蛋白酶(AP)基因的cDNA序列,明确其在葡萄抗病防御机制中的作用。【方法】在前期获得的中国野生毛葡萄株系"商-24"AP基因(VqAP)EST序列的基础上,采用RT-PCR克隆AP基因的cDNA序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并通过实时定量PCR和半定量PCR,分析VqAP基因在白粉菌诱导不同时间(0,6,12,24,48,72,96和120h),不同激素(100μmol/L水杨酸,50μmol/L乙烯和0.5g/L茉莉酸甲酯)刺激及不同组织(嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须)中的表达情况。【结果】序列分析表明,VqAP基因序列长度为1 377bp,具有开放阅读框,编码458个氨基酸残基,相对分子质量为50.48ku,等电点为8.73。保守结构域分析表明,VqAP编码产物含有2个保守的具有催化活性的天冬氨酸残基,位于Asp-Thr/Ser-Gly(DT/SG)结构域,该基因编码的氨基酸序列属于植物天冬氨酸蛋白酶A1家族,为非典型的天冬氨酸蛋白酶。荧光定量PCR结果表明,接种白粉菌后6h,VqAP基因表达量为0h的6倍多,之后迅速下调;不同激素处理后,该基因也均诱导表达,这可能是由于VqAP基因参与了植物早期的抗病反应,以及由不同激素诱导的发病相关基因的调节作用。半定量PCR结果表明,在葡萄嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同组织中VqAP基因的表达量不同,这可能与它参与了植物不同组织中功能蛋白的合成与降解有关。【结论】VqAP的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控,可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。 相似文献
2.
利用RT-PCR技术从山荆子cDNA中克隆CBF基因,ORF全长756 bp,编码252个氨基酸;其氨基酸序列含典型的CBF基因蛋白保守的序列AP2/EREB DNA结合域及CBF家族蛋白特征短多肽序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR);与Genebank上收录的几种植物CBF基因进行氨基酸同源性比对,结果发现山荆子CBF转录因子MbCBF和苹果CBF/DREB1基因的氨基酸序列相似性为98%;与梅树CBF相似性为67%;进一步构建了植物表达载体,为利用CBF基因提高植物抗逆性奠定基础。 相似文献
3.
[目的]对云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)成虫热激蛋白20基因(TynHSP20)进行克隆和序列分析,为研究该虫在高温环境下的抗逆机制打下基础.[方法]采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆云南切梢小蠹成虫TynHSP20基因cDNA序列,并对其序列进行生物信息学分析.[结果]克隆获得的TynHSP20基因cDNA序列长671 bp,含开放阅读框597 bp,5'端非编码序列和部分3'端非编码序列分别为44和33 bp.该基因编码198个氨基酸,预测蛋白质分子量为22.50 kD,等电点为7.86,包含一个保守的α-晶体蛋白结构域.同源性比对分析结果表明,TynHSP20蛋白氨基酸序列与东亚飞蝗、蓼蓝齿胫叶甲、斜纹夜蛾和美洲斑潜蝇的HSP20氨基酸序列相似性均低于20%.系统发育分析结果显示,TynHSP20与沙葱萤叶甲的亲缘关系较近.[结论]成功克隆获得TynHSP20基因cDNA序列,该基因具有小热激蛋白家族的特征,但与其他物种小热激蛋白的同源性较低. 相似文献
4.
【目的】克隆巴什拜羊杀菌/通透性增强蛋白(BPI)的cDNA序列,为研究该蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到中性粒细胞后提取RNA。根据GenBank中牛BPI基因的cDNA序列设计兼并引物,用RT-PCR方法扩增巴什拜羊BPI基因部分序列,再根据已知的巴什拜羊BPI基因部分序列设计RACE引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,分别回收克隆的目的基因片段,再与pMD18-T载体连接,分别转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后进行拼接,获得巴什拜羊BPI基因全长cDNA序列,并对序列进行分析。【结果】克隆的巴什拜羊BPI基因cDNA序列全长1 922bp,其中开放阅读框为1 452bp,共编码483个氨基酸;BLAST分析表明,巴什拜羊BPI基因的核苷酸序列与绵羊、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾核苷酸的一致性分别为99%,91%,78%,74%,64%,61%,58%,53%和50%;氨基酸进化分析显示,巴什拜羊首先与绵羊聚为一类,其次与牛聚为一类,该聚类分析结果与生物学分类结果表现一致。【结论】通过RACE方法成功地克隆了1 922bp的巴什拜羊BPI基因cDNA全长序列,且基因进化树聚类结果与生物学分类结果相一致。 相似文献
5.
【目的】对蕙兰CfMADS1基因cDNA全长进行克隆和时空表达特性研究,为研究成花相关基因的功能提供参考。【方法】以蕙兰萼片cDNA为模板,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,克隆获得CfMADS1全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。以蕙兰各时期的器官组织为材料,利用荧光定量PCR进行该基因的时空表达分析。【结果】成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登录号为KC148540),其cDNA序列全长1 061bp,开放阅读框长744bp,编码247个氨基酸,分子式为C1 244H2 040N370O377S9。其编码的氨基酸序列与AP1/FUL亚家族中金钗石斛MADS1具有较高的同源性(85.43%),与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。该基因编码蛋白没有明显的信号肽和跨膜域,极可能位于细胞核内,具有MADS保守域(1-61aa)和相对保守的K区(87-178aa),而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML),二级结构中α-螺旋所占比例较高(55.63%),三级结构与月季、水稻和水仙MADS1蛋白结构非常相似。该基因在盛花期叶中表达最强烈,花蕾期叶、葶、蕾及营养期叶、盛花期葶中表达较为强烈,子房和营养期根中表达较弱,其余器官组织中表达痕量。【结论】从蕙兰萼片中克隆得到了CfMADS1cDNA全长序列,CfMADS1与蕙兰的成花诱导、花发育以及果实形成有关。 相似文献
6.
旨在获得白羽王鸽(Columba livia)卵清蛋白关联蛋白Y基因(OVALY)的cDNA序列,并进行生物信息分析。研究结果显示:OVALY基因cDNA全长为2 068 bp,其中5'非编码区序列180 bp,3'非编码区序列720 bp,开放阅读框1 164 bp,编码的蛋白分子量约44.19 ku,含氨基酸残基388个(GenBank∶KX230792);与NCBI数据库中朱鹮(Nipponianippon)OVALY基因序列同源性最高(81%),与白尾鹰(Haliaeetusalbicilla)和沙鸡(Pteroclesgutturalis)OVALY基因序列的同源性分别为80%和79%。经潜在糖基化位点和磷酸化位点预测分析发现,OVALY蛋白结构中潜在糖基化位点和磷酸化位点分别为4个和22个;经CDD(conserved domain database)数据库分析发现,OVALY蛋白具有丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的反应中心区域,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族。 相似文献
7.
以新疆盐生植物猪毛菜(Salsola collina Pall.)为材料提取总RNA,根据NHX1家族同源序列保守区设计1对简并引物,进行RT-PCR扩增,得到猪毛菜逆向运输蛋白基因cDNA中间一段619 bp序列。再用快速扩增cDNA 3’末端(3’RACE)方法,得到约1 000 bp 3’末端序列。将两段序列进行拼接,得到猪毛菜长为1 585bp(Gen Bank登陆号为EU072932)的逆向运输蛋白基因(SaNHX1)cDNA序列,编码370个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与同科耐盐植物盐角草相应序列同源性为85%和87%,研究为进一步克隆猪毛菜NHX1全基因序列和研究其功能打下基础。 相似文献
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石蒜捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的克隆和序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据捕光叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab)家族中的保守序列设计PCR引物,扩增出的约350bp cDNA小片段为分子杂交探针,对构建的石蒜全长cDNA文库进行杂交筛选,并结合PCR分析对阳性克隆进行测序分析验证,克隆了石蒜中1个Cab基因全长cDNA,命名为LrCab(GenBank 登记号:GU362887).LrCab长为1073 bp,从第50 bp开始至847bp含有1个开放阅读框和1个终止密码子,编码 265个氨基酸.LrCab编码的蛋白质预测的等电点和分子量分别为5.14和28 010.00 u.通过比较分析,LrCab DNA序列(GU362887)和编码的氨基酸序列与其他种属的Cab基因编码氨基酸序列相似性很高,表明Cab家族基因在进化过程中保守性高. 相似文献
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受PVY诱导的烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp的克隆与分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】通过筛选并克隆烟草抗马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)相关基因,分析其在不同诱导时间的相对表达量,揭示烟草抗病毒诱导的分子机理,以期为烟草抗病毒病育种奠定基础。【方法】通过抑制差减杂交和cDNA芯片从PVY诱导的抑制差减杂交文库中筛选上调表达(Ratio2)的基因中间片段,用RACE技术克隆其cDNA全长,并利用实时荧光定量PCR分析其在不同诱导时期的相对表达量。【结果】从受PVY诱导的烟草叶片中筛选一条595bp的基因中间片段并克隆得到一个全长为1770bp的天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp(GenBank登录号为GU144571),该基因编码506个氨基酸。多序列比对结果显示,该基因的编码产物与其它植物天冬氨酸蛋白酶家族成员具有高度的同源性,具有植物天冬氨酸蛋白酶典型的结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,Ntasp在PVY接种早期上调表达。【结论】克隆得到一个烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp,其表达受PVY侵染诱导。 相似文献
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[目的]克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础.[方法]在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列.扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达.[结果]通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa) OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB) 2330 bp序列.结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225 bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56 bp处,终止密码子(TGA)后有一段201 bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96 kDa,等电点pI=6.30.经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白.[结论]克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达. 相似文献
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《延边大学农学学报》2019,(4)
利用RACE和染色体步移技术首次从桦褐孔菌中克隆得到三磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)基因和启动子序列。桦褐孔菌GPD基因的cDNA序列全长1 223 bp,其中,编码区1 020 bp,共编码339个氨基酸,相对分子质量约为36.39 kDa,理论等电点为8.28。序列比对结果表明:桦褐孔菌GPD基因与鲍姆桑黄(Sanghuangporusbaumii)相似度为88%。利用染色体步移技术方法克隆得到GPD基因起始密码子上游446 bp启动子序列,分析表明在152 bp和160 bp处有2个转录起始位点,含有TATA、CAAT、CCAAT box及重要顺势作用元件LTR、O2-site、circadian、Sp1、TCCC-motif等,这将为桦褐孔菌菌株的分类鉴定、功能研究及高效表达载体的建立提供基因资源。 相似文献
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【目的】克隆和鉴定粘虫核糖体蛋白S11(Ribosomal Protein S11,RPS11)基因,为昆虫核糖体蛋白功能的研究提供基础资料。【方法】运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫cDNA为模板,对RPS11基因进行克隆,获得其全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对RPS11基因全长cDNA序列及推测得到的RPS11蛋白氨基酸序列进行分析,构建其系统进化树。【结果】获得的粘虫核糖体蛋白S11基因(RPS11)cDNA序列长度为521 bp,其中包括26 bp的5′非编码区、36 bp的3′非编码区和459 bp的开放阅读框,编码一个由152个氨基酸组成的蛋白,其具有核糖蛋白S17蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫RPS11蛋白的理论分子质量为17.737 9 ku,等电点为10.63,富含6种类型的特定功能位点,与同属夜蛾科的烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的RPS11蛋白相似性高达97%。用Neigh-bor-joining(NJ)法构建基于RPS11氨基酸序列的系统发育树,结果显示,粘虫RPS11与烟芽夜蛾(H.virescens)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)等3种鳞翅目昆虫的亲缘关系较近。【结论】成功获得了粘虫RPS11基因全长序列(GenBank登录号为GQ222274),由其编码的核糖体蛋白RPS11属于核糖蛋白S17蛋白家族。 相似文献
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为了获得香蕉穿孔线虫的组织蛋白酶B基因,分析该基因的序列、结构及其功能,为进一步研究植物寄生线虫组织蛋白酶的功能及其在线虫防治中的应用提供科学依据。我们应用SMART技术构建了香蕉穿孔线虫cDNA文库;采用SL法,克隆得到香蕉穿孔线虫组织蛋白酶B基因全长cDNA,通过测序获得1 257bp全长序列,命名为Rs-cb-1(GenBank:GU360972),该基因cDNA全长序列包括1 071bp的完整ORF,编码356个氨基酸,蛋白质相对分子质量为41 400。对该基因的序列结构及其编码的蛋白2级结构和三维结构与功能进行分析和预测结果表明,Rs-cb-1序列与其他寄生虫的组织蛋白酶B基因序列相比,该基因与秀丽小杆线虫组织蛋白酶B基因的亲缘关系最近;其编码蛋白主要为细胞外分泌蛋白,定位于微体(过氧化物酶体)、内质网膜和内质网管腔上,约有25个氨基酸跨膜区段位于蛋白质的C端,其表面电荷呈明显的极性分布;另外,通过同源建模获得该蛋白的三维结构预测图,这些结构与已报道的组织蛋白酶B生物学功能相符。本研究分离克隆得到的Rs-cb-1,是首个分离克隆得到的香蕉穿孔线虫组织蛋白酶B基因,从而为该线虫组织蛋白酶的进一步研究奠定了基础。 相似文献
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为梨小食心虫其他基因表达调控研究提供内参基因以及actin基因的研究,运用RT-PCR和RACE技术,克隆获得梨小食心虫actin基因全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该基因cDNA序列全长为1 451bp,其中包括67bp的5′非编码区、253bp的3′非编码区和1 131bp的开放性阅读框,编码376个氨基酸。该蛋白预测分子质量为41.776 8ku,等电点为5.22,氨基酸序列中有6类功能位点,具有actin家族典型特征,与其他昆虫actin氨基酸序列高度同源,达97%~99%。成功克隆梨小食心虫actin基因全长cDNA,该序列已提交GenBank,登录号为KF022227。 相似文献
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用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)ScGSP1蛋白基因从COGEME植物病原菌EST库中BLAST得到栗疫病菌的GSP1蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为651 bp,编码216个氨基酸残基组成的GSP1蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析表明,GSP1蛋白前体包括GTPase结合结构域和碳端细胞核定位序列,与21个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌GSP1蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性. 相似文献
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为了探究Y-box基因在刺参Apostichopus japonicus胚胎发育及性别分化中的作用,根据已有的EST序列,通过RACE技术克隆了刺参Y-box基因的cDNA全长序列,并利用实时定量PCR技术进行了表达模式分析。结果表明:刺参Y-box基因cDNA全长为1 142 bp,5’端UTR为102 bp,3’端UTR为215 bp,开放阅读框(ORF)为825 bp;Y-box基因cDNA全长编码274个氨基酸的前体蛋白,预测蛋白的相对分子质量为31 100,理论等电点为9.46,是亲水性蛋白;刺参Y-box氨基酸序列包含氨基酸N末端结构域、C末端结构域和冷休克结构域(CSD),其中CSD区在Y-box结合蛋白家族中非常保守;刺参Y-box结合蛋白质的二级结构没有α-螺旋和β-折叠,无规则卷曲占87.23%,延伸链占12.77%;刺参与其他物种的Ybox氨基酸的相似度为27%~41%,在冷休克区相似度很高,达到75%以上;构建的系统进化树表明,刺参与加州海兔Aplysia californica、栉孔扇贝Chlamys farreri、玻璃海鞘Ciona intestinalis聚为一支,为海洋无脊椎动物;经实时定量PCR检测,Y-box基因在小耳幼体中表达水平最高,且显著高于其他各发育阶段(P<0.05),在雄性性腺中的表达量显著高于雌性性腺(P<0.05)。研究表明,Y-box基因在刺参的胚胎发育及性别分化中发挥重要作用。 相似文献
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[目的]克隆黑眶蟾蜍皮肤丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。[方法]从海南海口产黑眶蟾蜍皮肤中抽提总RNA,经mRNA纯化后构建黑眶蟾蜍皮肤cDNA文库。根据已报道的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)序列,设计寡核苷酸引物用于筛选、克隆、测序。[结果]从所构建的cDNA文库中得到1个Serpin基因,命名为BmSP。对cDNA序列推导出的氨基酸序列分析表明,该BmSP蛋白属于Serpin家族中SERPIN B亚家族,与鼠鳞状细胞癌抗原2(SCCA2)同源。该蛋白C末端含有一个RCL环(Reactive center loop regions)和一段高度保守的五肽。[结论]与SERPIN B亚家族中其他类型蛋白氨基酸序列比较结果表明,黑眶蟾蜍BmSP与SERPIN B亚家族中其他类型成员氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性,可能在其防御天敌捕食的过程中发挥重要作用。 相似文献
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草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】从草莓（Fragaria×ananassa）中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。 相似文献
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为研究透明带ZP家族在小体鲟Acipenser ruthenus性腺发育、卵子发生等过程中所发挥的作用,采用PCR技术克隆获得小体鲟卵透明带家族ZP3 3种亚型(ArZP3-1、ArZP3-4、ArZP3-5)及ZPAX基因(ArZPAX)cDNA部分序列。结果表明:ArZP3-1部分cDNA序列长度为1029 bp,对应编码342个氨基酸;ArZP3-4部分cDNA序列长度为1191 bp,对应编码397个氨基酸;ArZP3-5部分cDNA序列长度为717 bp,对应编码238个氨基酸;ArZPAX部分cDNA序列长度为733 bp,对应编码243个氨基酸;ArZP3蛋白3种亚型及ArZPAX蛋白氨基酸序列中均含有一个保守的ZP结构域;基于ZP氨基酸序列的系统发育树显示,小体鲟ArZP3蛋白3种亚型与高等鱼类ZP3亲缘关系较近,而ArZPAX蛋白则与哺乳类、鸟类、高等鱼类和爬行类ZPAX亲缘关系均较远;通过半定量RT-PCR进行组织表达特异性分析表明,ArZP3-1基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、脑、肾、心、肌肉、鳃中表达,ArZP3-4基因仅在小体鲟卵巢和精巢中表达,而ArZPAX基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、肠、肾、脾、心、鳃、脑中均有表达,3个基因在性腺中的表达量均最高,且均具有雌、雄差异性表达特点。 相似文献