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香蕉束顶病毒海口分离物CP基因的原核表达、纯化及其抗血清制备 总被引：1，自引：1，他引：0
用PCR方法从感染香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增外壳蛋白(coat protein,CP)基因。回收目的片段,经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样酶切的质粒载体pET30a(+)相连接,酶切验证及测序结果获得了含BBTV CP基因的重组质粒pET30a-CP。将重组质粒转化Codon plus表达菌,在25℃、0.4mmol/L IPTG条件下诱导6h或过夜,经12%SDS-PAGE电泳分析可知,该重组菌表达了一个与预期分子量大小一致的His-CP融合蛋白,约为30ku,且主要以包涵体的形式存在。多次洗涤包涵体后得到高纯度的融合蛋白,用其免疫家兔,获得BBTV CP蛋白抗血清。间接ELISA法测定抗血清效价大于51200。Western blot分析表明,抗血清能与融合蛋白特异性结合。 相似文献
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根据文献并结合生物信息学方法选取大豆主要过敏原Gly m Bd 30k的抗原表位区,采用PCR方法扩增出该抗原表位区基因片段,并通过酶切连接分别构建单体的pET表达载体(pET-sGly)和二聚体的pET表达载体(pET-dGly),重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析;同时用Ni2+离子亲和层析柱纯化表达的sGly和dGly抗原表位蛋白,用western-blotting和ELISA检测重组蛋白的免疫原性。结果表明:表达的单体sGly蛋白以可溶性表达为主,而其二聚体dGly蛋白以包涵体形式存在,纯化的sGly和dGly蛋白都具有较好的免疫原性,重组蛋白sGly的抗原性更佳。成功构建的大豆主要过敏原Gly m Bd 30k蛋白的抗原表位区单体sGly蛋白及其二聚体dGly蛋白的工程菌,为研制大豆主要过敏原的单克隆抗体以制备用于大豆主要过敏原检测的试剂奠定了基础。 相似文献
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《中国糖料》2014,(2)
根据已发表ScYLV-P0基因系列设计特异性引物,应用RT-PCR技术从甘蔗病叶的mRNA扩增得到目的 DNA片段。以pET32a(+)为原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-P0。经过双酶切鉴定和DNA测序后,将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)pLySs,在30℃培养条件下IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况。表达结果显示,在该表达系统中,融合表达蛋白P0是以包涵体形式的蛋白存在;P0融合蛋白大小约45kDa,与P0开放阅读框的理论推算值29.991 kDa加上载体自身蛋白约18 kDa相符,用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清,通过酶联法(ID-ELISA)测定本实验制备的ScYLY-P0抗血清工作浓度为1∶25000。 相似文献
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《大豆科学》2015,(6)
为了解大豆蚜(Aphis glycines Matsumura)传播的大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)与其体内共生菌产生的病毒结合蛋白(Gro EL)之间的作用机制,运用RT-PCR技术克隆得到大豆蚜内共生菌groEL基因全序列,把该基因与pET21b载体重组后进行原核表达,经Ni-Agarose His亲和层析得到纯化的蛋白,并利用荧光定量PCR技术分析了饲毒不同时间、不同龄期大豆蚜内共生菌gro EL基因表达量的变化。序列分析表明:大豆蚜内共生菌groEL基因全长序列为1 647 bp,编码548个氨基酸,推测蛋白分子量和pI值分别为69 k Da和5.24,成功构建重组载体pET21bGro EL进行原核表达,Western-blot鉴定确定为目的蛋白,蛋白可溶性分析发现重组蛋白为包涵体。随饲食SMV时间的延长大豆蚜内共生菌groEL的表达量显著增加,且无翅成虫与有翅成虫内共生菌groEL的表达量显著高于其它4个若虫期。大豆蚜内共生菌groEL基因能在原核细胞中稳定、正确表达,并且大豆蚜在饲食SMV后会诱导其内共生菌gro EL的表达,从而增加SMV爆发流行的可能性。 相似文献
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应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。 相似文献
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以连接在pMD-18T载体上的香蕉条斑病毒云南分离物(BSV)全基因组为模板,设计特异引物,PCR扩增获得ORFⅠ全长序列。目的片段及原核表达载体pET32(b)分别经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接构建重组质粒pET32-ORFⅠ,将鉴定为正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,获得原核表达OFRⅠ工程菌。工程菌在28℃条件下,用浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达6 h,离心收集菌液并超声波破碎,获得以含目的肽段的可溶性蛋白为主的融合蛋白。将融合蛋白通过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后,得到纯度较高的融合蛋白。以此蛋白为抗原免疫家兔,获得特异抗血清,该抗血清的效价达1∶100 000,Western Blot验证表明,抗血清的特异性较强。本研究为BSV的快速检测以及BSV编码蛋白的功能研究奠定了基础。 相似文献
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利用PCR方法分别扩增番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus,PRSV）、番木瓜畸形花叶病毒（papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）和番木瓜花叶病（papaya mosaic virus,PaMV）的外壳蛋白（coat protein,CP）基因,并连接到原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET28-PRSV-CP、pET28-PLDMV-CP和pET28-PaMV-CP,通过转化、诱导表达后,经SDS-PAGE分析显示,这3种CP蛋白在大肠杆菌中高效表达,其中PRSV CP蛋白和PLDMV CP以包涵体形式存在,PaMV CP以可溶蛋白形式存在。利用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化获得了3种病毒的重组CP蛋白,并免疫大白兔获得高效价的抗体。Western blot检测结果表明,这3种抗血清与对应的诱导表达蛋白发生特异反应。再采用抗血清建立一种快捷、简便和低成本的ID-ELISA（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay）技术,并利用此技术对海南岛283个疑似感病的番木瓜样品进行检测鉴别,初步掌握了海南岛3种主要番木瓜病毒的分布及感病情况,为下一步该病的有效防治策略提供科学依据。 相似文献
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植物JAZ蛋白是茉莉酸信号调控途径的关键环节之一。HbJAZ3基因是橡胶树乳管细胞中编码JAZ蛋白的基因家族成员之一。本文采用原核表达和定点突变技术,构建了pET28a（+）-JAZ3、pET28a（+）-JAZ3-ZIM-mut（缺失ZIM结构域中TIFY基序）和pET28a（+）-JAZ3-Jas-mut（缺失Jas结构域的保守氨基酸FLEKRK）的His标签融合蛋白表达载体,并成功转化大肠杆菌Rosetta（DE3）。在37 ℃条件下,用1 mmol/L IPTG诱导2 h能够诱导目的蛋白以包涵体的形式大量表达。通过镍柱纯化了目的蛋白,获得了HbJAZ3及其ZIM结构域和Jas结构域的突变体蛋白,为进步一鉴定乳管细胞茉莉酸信号途径的关键环节打下了良好基础。 相似文献
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水稻黑条矮缩病病毒外壳蛋白基因S10的原核表达、多克隆抗体制备及应用 总被引：7，自引：2，他引：5
用RT-PCR方法从感染水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)水稻中克隆该病毒的外壳蛋白基因S10,然后将此外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体PET-32a中构建成重组原核表达载体pET32a-CP。将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni+ NTA亲和柱纯化获得分子量约为76kD含硫氧还蛋白的融合蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子制备RBSDV外壳蛋白的多克隆抗体,并用制备的多克隆抗体建立了可靠、灵敏、特异的检测RBSDV的免疫捕获RT-PCR及Dot-blot ELISA方法,为该水稻病毒病的诊断提供技术支持。 相似文献
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番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)编码的核内涵体蛋白a蛋白酶(Nuclear inclusion body a proteinase,NIa-Pro)是一种多功能病毒非结构蛋白,在病毒侵染宿主及病毒与宿主互作中起着重要作用。本研究利用以麦芽糖结合蛋白(MBP)为融合表达框架的原核表达系统构建了表达NIa-Pro的重组载体pMAL-c5xNP,并转化大肠杆菌,经IPTG诱导和Ni~(2+)-NTA-琼脂糖亲和层析纯化获得了可溶的重组融合蛋白MBP-NIa(N端和C端分别融合MBP和His标签),然后利用蛋白酶Factor Xa切去重组融合蛋白中的MBP,再通过直链淀粉树脂亲和层析纯化获得了可溶的重组蛋白NIa-Pro。活性检测结果表明,重组蛋白PRSV-NIa-Pro具有非特异的双链DNA酶和特异的蛋白酶双重活性。 相似文献
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根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因(Ac Pmp)序列设计1对特异引物mp-FP/mp-RP,以病样槟榔总DNA为模板扩增该Ac Pmp的编码区并连接到p MD19T simple中间载体。将测序正确的阳性菌提取质粒p MD19T-Ac Pmp,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后回收Ac Pmp片段,然后以正确的编码框连接到原核表达载体p ET32a(+),转化Escherichia coli BL21感受态细胞。含有p ET32a-Ac Pmp的BL21表达菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,在30℃,0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4 h,可产生部分可溶性的融合蛋白。利用Ni2+-NTA亲和层析柱法进行纯化并获得高纯度的可溶性融合蛋白。将纯化后的融合蛋白多次免疫家兔,取其抗血清,以融合蛋白(1∶10 000稀释)作抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。Western Blot杂交结果表明槟榔植原体膜蛋白抗血清能与融合蛋白特异性结合。 相似文献
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香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是危害香蕉的主要病毒之一,严重威胁着香蕉的生产.BBTV基因组至少由6个环状ssDNA组分组成,其中DNA2组分变异最大,是否编码蛋白及其功能缺乏研究.本研究通过PCR方法克隆了BBTV Haikou2 DNA2ORF,将其构建到pET32a载体中,进行原核表达和抗血清制备.结果表明重组表达载体pET32a-DNA2ORF在表达菌Transetta(DE3)中表达一个约21 ku的特异融合蛋白,通过超声波破碎仪破碎细胞和诱导条件优化,分析表明,该蛋白主要以可溶形式存在,最佳表达条件为30℃、1.0 mmol/L IPTG诱导3h.融合蛋白经过Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化,免疫家兔制备出抗血清.Western blot实验表明抗血清具有特异性; 酶联法(ID-ELISA)测定表明,抗血清效价达到25 000,能够检测出香蕉汁液中加入的0.954 μg/mL浓度的表达纯化蛋白. 相似文献
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茶树α-tubulin基因的原核表达及其多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
根据茶树α-微管蛋白(α-tubulin)的mRNA全长序列(GenBank登录号DQ340766)设计引物,以RT-PCR方法扩增茶树α-tubulin基因,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,并转化至大肠杆菌BL21trxB(DE3)中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式表达。以纯化后的α-tubulin融合蛋白制备兔多克隆抗体,用Westernblot方法检测抗体特异性。结果显示α-tubulin蛋白以包涵体形式大量表达,以融合蛋白制备的抗体对茶树体内的α-tubulin具有良好的特异性。 相似文献
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采用RACE技术扩增2株Bacillus属菌株XY18、XY20的β-D-葡萄糖苷酶编码基因bgl全长,构建重组载体pET28a(+)/bgl、pET28b(+)/bgl,导入E. coli BL21诱导表达,采用Ni亲和层析纯化蛋白。经酶学性质测定发现：2个蛋白均为弱酸性蛋白,温度为40 ℃时酶活力达到最大,具有一定耐热性。以上结果表明,为优化2株Bacillus属菌株参与香草兰发酵工艺,可提供适当弱酸性条件、适宜温度。 相似文献
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运用生物信息学软件对湘油15 PGIP9基因的核苷酸、蛋白氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测.结果表明:湘油15 PGIP9编码区CDS长1011 bp,编码336个氨基酸的开放阅读框,分子量为37.5kDa,等电点为7.9.N端1～22个氨基酸是信号肽,且这一区域疏水性较强,具有5个潜在的N-糖基化位点.N端和C端还各具有4个参与二硫键形成的半胱氨酸残基.二级结构显示有11个α-螺旋,14个β-延伸和25个无规则卷曲.中心LRR结构域由6个串联的LRR基序组成.随后将PGIP9的CDS序列亚克隆到原核表达载体pET -32a(+)中,构建pET - 32a - PGIP9重组表达质粒,并转化E.coil BL21(DE3),25℃,终浓度为0.2 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG诱导2h,都成功的表达了融合蛋白pET - 32a - PGIP9,其分子量约为52kDa,发现主要以包涵体形式存在.没有可溶形式的蛋白表达. 相似文献
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为研究芒果MiRab11蛋白的互作及其它生物学功能,本文在MiRab11基因序列基础上,采用重叠PCR定点突变技术,获得了2个结构域突变体Mi-Rab11CA和Mi-Rab11DN,将其构建原核表达载体,并成功转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE结果显示,在28℃条件下,用0.5 mmol/L IPTG诱导4 h,可获得大量可溶性蛋白的表达。将可溶性蛋白经Ni-NTA argrose层析柱纯化并western blot鉴定,该重组蛋白均可与抗His单克隆抗体发生特异性免疫反应。本研究为深入研究芒果pET-Rab11蛋白生理活性、特异性结合位点及功能调控打下良好基础。 相似文献
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以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到几丁质酶基因chiD序列,再将chiD序列连接到pMD18-T克隆载体上,形成重组载体pMD18-T-chiD,转化大肠杆菌DH5ɑ并测序,经过核苷酸和氨基酸序列分析获得几丁质酶基因chiD的序列片段为1 524 bp,编码507个氨基酸,理论蛋白质分子量约54.55 ku,其等电点约为5.77,表明该几丁质酶为酸性几丁质酶。将重组质粒pMD18-T-chiD双酶切后与表达载体pET-28a连接,构建重组表达载体pET28a-chiD,并转入大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,结果表明:重组蛋白质的分子量约55 ku,与预测的蛋白分子量结果一致。为了提高重组蛋白的表达量,对培养时间、IPTG浓度和温度3个参数进行优化,并将表达产物进行SDS-PAGE分析,最后得出重组载体pET28a-chiD的最佳诱导表达参数分别为8 h、0.5 mmol/L和28℃。这为短短芽胞杆菌来源的几丁质酶的进一步研究奠定了良好基础。 相似文献