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1.
本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。 相似文献
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猪Ⅱ型圆环病毒ORF2截短基因的表达纯化及动物免疫试验 总被引：1，自引：0，他引：1
在最佳诱导条件下获得猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）重组Cap蛋白,表达产物经可溶性分析表明该重组蛋白主要以包涵体形式存在。大量诱导表达重组Cap蛋白,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,通过Western blotting检测证明表达产物具有良好的免疫原性。用该纯化的重组蛋白作为亚单位疫苗,与本实验室所构建保存的pcDNA3.1-ORF2分别免疫BALB/c小鼠,对亚单位疫苗和基因疫苗做了对比试验,为进一步研制PCV2基因工程苗奠定良好的基础。 相似文献
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为了表达猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3) Cap蛋白,按照昆虫细胞密码子偏嗜性对ORF2基因进行优化并在N端加上His标签基因,合成的ORF2基因片段克隆入pFastBac Dual杆状病毒穿梭载体;将重组质粒转化大肠杆菌DH10-Bac感受态后通过蓝白斑筛选获得重组杆粒Bacmid-C2;将重组杆粒转染至SF9细胞5 d后收集细胞上清液;连续传代3次观察细胞病变。将接毒后的SF9细胞样通过Western blot及间接免疫荧光(IFA)进行Cap蛋白表达的鉴定。利用蔗糖密度梯度离心对病毒样颗粒的Cap蛋白纯化后进行透射电镜观察。结果显示：SDS-PAGE和Western blot检测发现重组杆状病毒在昆虫细胞中能够有效表达Cap蛋白,且与His-tag单抗及PCV3阳性血清发生特异性反应;IFA进一步鉴定感染了重组病毒的昆虫细胞与His单抗产生特异性荧光;透射电镜可以明显观察到14～17 nm左右形态规则的病毒样颗粒(VLPs)。PCV3 Cap蛋白的成功表达和鉴定将为研究Cap蛋白的免疫原性和空间结构奠定基础,也为探讨开发PCV3的亚单... 相似文献
4.
重组新城疫病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(rLa-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(Cap△41)的重组病毒(rLa-PCV2/Cap△41),并对外源蛋白的表达效果进行了检测.通过间接免疫荧光试验证明,两种重组病毒感染的BHK-21细胞中,PCV2 Cap蛋白以及删除NLS的Cap△41蛋白均获得正确表达;其中,完整的Cap蛋白定位于核内,而删除NLS的Cap△41蛋白则定位于胞浆中,本研究结果为研究新型PCV2疫苗奠定基础. 相似文献
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猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(2):218-223
采用融合PCR方法将猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因和人单纯疱疹病毒Ⅰ型病毒(HSV-1)VP22蛋白转导域串联得到Cap-VP22基因,将其插入到杆状病毒转移载体pFastBac Dual构建pFast-Cap-VP22重组转移载体,通过转化含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含Cap-VP22基因的重组穿梭质粒rBac-2Cap-VP22。重组穿梭质粒转染昆虫细胞(Sf9),获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞,通过PCR、间接免疫荧光(IFA)、电镜观察对表达产物进行检测。结果表明,成功构建含双拷贝Cap-VP22基因的杆状病毒载体,IFA证实重组蛋白在Sf9细胞中获得正确表达,与PCV2阳性血清具有良好的反应原性;电镜观察结果显示细胞上清中的目的蛋白可装配形成直径约17nm的病毒样颗粒(VLPs);表明C端融合VP22蛋白转导域序列并不影响Cap蛋白的组装。本研究为进一步研制安全、高效的PCV2疫苗奠定基础。 相似文献
7.
将猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白第165-200位氨基酸多肽基因嵌合在猪细小病毒（PPV）VP2 N端,然后重组到腺病毒pAdEasy-1表达系统中,转染HEK-293A细胞,获得重组腺病毒（rAd-PPV∶VP2-PCV2∶Cap）。IFA和Western blotting分析分别可见特异性荧光和大小约为64 ku的特异性带,表明rAd-PPV∶VP2-PCV2∶Cap在HEK-293细胞中成功地表达了PPV∶VP2和PCV2∶Cap蛋白。红细胞凝集试验证实,表达的嵌合PPV∶VP2-PCV2∶Cap蛋白具有与PPV全病毒类似的血凝活性。电镜观察嵌合PPV∶VP2-PCV∶Cap蛋白的粗提物,发现可自行装配成许多病毒样粒子[PPV∶VLP（PCV2）]。 相似文献
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以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。 相似文献
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本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）PCV2b的ORF2基因插入供体质粒pFastBacTMⅠPPH启动子控制下的多克隆位点,构建的质粒转化DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-cap。将rBacmid-cap转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验证明目的蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了表达。将该重组杆状病毒感染HighFiveTM细胞后,用Western blot在细胞培养上清中检测到了目的蛋白,并于d 5达到表达高峰。电镜观察结果显示上清中的目的蛋白可以装配成直径约为17 nm的病毒样颗粒。病毒样颗粒在培养上清中的大量存在,为目的蛋白进一步的分离和纯化提供了便利,也为PCV2基因工程疫苗的产业化奠定了基础。 相似文献
10.
《中国畜牧兽医》2020,(8)
本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型(PCV3)重组核衣壳(Cap)蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。 相似文献