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《畜牧兽医学报》2016,(3)
本研究旨在筛选出新西兰白兔不同时期不同器官中表达最稳定的内参基因。以胚胎期(E28.5)、幼龄期(10d)和成年期(A)3个阶段的新西兰白兔的肾、心和肝3种组织作为研究对象,按照RT-qPCR试验最低要求试验信息量(MIQE)的指导,运用RT-qPCR和在线内参基因稳定性评价工具RefFinder,比较6个常用的内参基因(GAPDH、HPRT1、18S rRNA、B2 M、Sdha、β-actin)mRNA的表达稳定性。结果表明,新西兰白兔的肝和肾组织中的6个内参基因在3个发育阶段最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH,而在心组织中最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、Sdha。在新西兰白兔胚胎期的3种组织中,最稳定的3个内参基因依次是GAPDH、β-actin、HPRT1,而在幼龄期和成年期最稳定的3个内参基因依次是HPRT1、GAPDH、β-actin。对新西兰白兔的3个发育阶段和3种组织的内参基因稳定性结果分析表明,最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH。本研究证实,新西兰白兔不同的发育时期和组织中,最稳定的内参基因不同。推荐在进行新西兰白兔的相关试验时,可以选择上述表达最稳定的至少3个内参基因的几何平均数作为标准化相关RT-qPCR数据的指标,以确保试验组个体间的差异最小,和小变量的准确数据分析。 相似文献
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肌肉生长抑制素（MSTN）是骨骼肌发育的主要调控因子，为获得新西兰白兔MSTN基因序列及其表达规律，试验通过RT-PCR技术从新西兰白兔腿肌组织中扩增并克隆得到MSTN基因序列，利用在线网站对其进行生物信息学分析，并采用实时荧光定量PCR技术检测MSTN基因在新西兰白兔同一时期不同组织及不同时期腿肌组织中的表达量。结果显示，新西兰白兔MSTN基因CDS区序列长1 128 bp，编码375个氨基酸，其核苷酸序列与GenBank上公布的人、猪、马、小鼠、犬、牛和鸡的核苷酸序列相似性分别为95.9%、94.9%、94.9%、91.7%、91.5%、91.3%及84.2%。新西兰白兔MSTN蛋白属于酸性、亲水性分泌蛋白，且具有不稳定性，不含跨膜结构，含有1个信号肽，主要分布在内质网和线粒体中。MSTN蛋白二级结构和三级结构预测结果一致，以无规则卷曲为主，其次是α-螺旋、延伸链，为混合型蛋白。蛋白质互作关系预测发现，MSTN蛋白与PAX7、MYOG、IGF1、FST、Smad3及Smad2等与肌肉生长发育有关的蛋白之间存在相互作用。不同组织表达分析结果表明，新西兰白兔MSTN基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腿肌、子宫和胃中均有表达，在腿肌中表达量最高，极显著高于其他组织（P<0.01），其次是肾脏，在肝脏中的表达量最低。不同时期腿肌组织中的表达量分析结果显示，新西兰白兔MSTN基因在180日龄腿肌组织中的表达量显著高于90和240日龄（P<0.05）。研究结果为深入探讨MSTN基因对家兔肌肉生长发育的调控机制奠定了基础。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2016,(11)
本研究旨在克隆山羊CC类趋化因子受体基因(CCR2)的CDS区序列,并检测其在山羊不同组织中mRNA和蛋白表达水平,从而为CCR2基因在山羊脂代谢中的作用研究奠定基础。选取2~3周岁的健康简州大耳羊和藏山羊羯羊各4只,屠宰后分别采集心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮下脂肪组织,分别提取组织总RNA及总蛋白,利用RT-PCR法克隆山羊CCR2基因序列,进行生物信息学分析,并利用实时定量PCR法和Western blot分别检测CCR2基因mRNA和蛋白的表达水平。结果显示,克隆得到CCR2基因cDNA序列1 186bp,包含CDS全长1 100bp,5′UTR 2bp和3′UTR 74bp,编码370个氨基酸残基。山羊CCR2氨基酸序列与牛、猪、小鼠、人的相似性分别为97.3%、91.9%、77.0%和69.2%。山羊CCR2基因与牛具有最近的亲缘关系,其次为猪、狗和小鼠,而与人的亲缘关系较远。组织表达结果显示,CCR2在两种山羊肾和心中均具有较高的表达水平,而在皮下脂肪和肌肉中的表达水平较低。这些结果表明,CCR2可能在山羊脂质代谢过程中具有重要的调控作用。 相似文献
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本试验旨在研究布莱凯特黑牛CB1基因CDS区序列和表达情况,探讨CB1基因与脂肪沉积的关系。运用RT-PCR技术克隆CB1基因CDS区序列,并进行生物学分析;运用qRT-PCR技术检测不同组织的mRNA相对表达量;以及运用免疫组化技术对蛋白进行定位分析,运用Western blot技术检测CB1蛋白在不同组织的表达量。结果显示,克隆获得的布莱凯特黑牛CB1基因CDS为1495 bp,编码477个氨基酸。进化树显示布莱凯特黑牛CB1基因与牛、山羊、绵羊同源性最高(>98%)。qRT-PCR结果显示CB1基因在不同组织均有表达,在脂肪组织中相对表达量最高;免疫组化显示CB1基因主要在脂肪细胞膜上表达;Western blot结果显示CB1蛋白在脂肪组织和肌肉组织均有表达,在脂肪组织表达量显著高于肌肉组织。综上推测,CB1基因参与脂质代谢相关调节过程,为肉牛肉质性状的分子选育提供参考。 相似文献
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本研究分析了五指山试验用小型猪TIMP-2基因的分子特性和可能的生物学功能.将人TIMP-2 mR-NA全长序列在猪ESTs数据库中检索获得同源性较高的ESTs,用电子克隆结合RT-PCR方法克隆获得包含完整CDS区的猪TIMP-2基因cDNA序列,应用生物信息学方法分析了其核苷酸序列及其编码蛋白质分子结构特性,应用RT-PCR研究该基因在猪不同组织和发育时期的特异表达情况.结果,猪TIMP-2 cDNA序列全长790 bp,包括663 bp的完整开放阅读框,编码221个氨基酸.多序列比对和系统进化分析表明,该基因编码蛋白质与人(97%)、大鼠(97%)、小鼠(97%)等物种TIMP-2蛋白质具有较高的同源性.蛋白质序列预测分析发现,猪TIMP-2氨基酸序列理论等电点(pI)为7.65,相对分子质量(MW)为24.5 ku,它包括27AA的前导序列和194AA的成熟肽段,其前导序列比其它物种多1个亮氨酸(Leu).结构功能预测发现其具有1个在种间高度保守的NTR_TIMP结构域和N端VIRAK保守序列,序列中存在的12个半胱氨酸(Cys)可以形成6对二硫键结构.表达谱分析表明TIMP-2基因在猪的多个组织和不同发育时期的表达量存在较大差异,在睾丸、垂体、胃、大肠、卵巢、子宫和90 d胚胎骨骼肌中高表达;而在心脏、小肠、脑、肝脏、成年猪骨骼肌中表达量极低;在肾脏、胸腺、脾、甲状腺、33 d胚胎中中度表达.结果表明该基因在发生组织发育和重构活动相对活跃的组织器官和时期表达水平较高,亦符合其固有生物学功能. 相似文献
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《中国畜牧杂志》2019,(9)
本研究旨在克隆草原红牛脂肪酸结合蛋白7基因(FABP7)的CDS区序列并对其进行生物信息学分析,同时检测其在牛各个组织中的mRNA表达水平。利用RT-PCR技术克隆草原红牛FABP7基因CDS区序列,并使用多种生物软件和在线工具进行生物信息学分析,通过qPCR技术检测FABP7基因在各组织间mRNA的表达水平。结果表明:草原红牛FABP7基因CDS区全长399 bp,编码132个氨基酸,蛋白分子量为14.96 ku,理论等电点为5.38,属于亲水性蛋白;通过NCBI-BLAST对比发现,草原红牛与普通牛、羊、猪、人、鼠、鸡的核苷酸序列同源性分别为99%、98%、94%、92%、85%、85%,系统进化树结果发现,草原红牛与普通牛亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远;FABP7蛋白序列有1个二硫键,14个磷酸化位点,1个N-糖基化位点,不存在信号肽和跨膜区;在蛋白的二级结构和三级结构中发现,FABP7蛋白主要存在2个α-螺旋结构和10条β-折叠,为混合型蛋白。FABP7基因在小肠组织表达量最高,在心脏、脂肪和胃中中度表达。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2015,(23)
为了克隆水牛ATG5、LC3基因序列,并分析自噬相关基因在水牛各组织中的表达情况,试验采用RT-PCR技术克隆了水牛自噬相关基因ATG5、LC3序列,并对其CDS序列进行了生物学信息分析,同时利用QRT-PCR方法,对ATG3、ATG5、ATG6、ATG7、ATG12、LC3、BECN1 7个基因在胎水牛心脏、肝脏和肌肉等9种组织、成年水牛卵巢中的mRNA表达水平进行了分析。结果表明:克隆得到水牛ATG5基因序列980 bp,其中包括CDS序列828 bp,预计编码275个氨基酸;水牛LC3基因mRNA序列全长499 bp,包括CDS序列378 bp,预计编码125个氨基酸;所分析的7个自噬相关基因在10种水牛组织中均有不同程度的表达。 相似文献
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猪Fosl2基因克隆、结构预测及其mRNA发育性表达变化 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验旨在克隆猪Fosl2基因CDS序列并对其进行分析,研究该基因在猪的不同阶段各种组织(心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、背部脂肪)中的发育性表达规律。以豫南黑猪为材料,利用RT-PCR技术克隆猪Fosl2基因CDS区域,利用生物信息学方法预测蛋白结构,应用qRT-PCR检测豫南黑猪7~180日龄上述组织中Fosl2基因的发育性表达。结果表明,猪Fosl2基因的CDS区为984bp,编码327个氨基酸,跨膜序列为17~33位氨基酸,该肽链没有信号肽,为跨膜非分泌型蛋白,在122~187位氨基酸的位置存在亮氨酸拉链结构域,核苷酸和氨基酸序列同其他种属间的保守性很高。Fosl2基因拥有广泛的组织表达谱,在心、肝、脾、肾、肺、背最长肌和背部脂肪的不同发育阶段均有不同程度的表达,而其在肺中的表达量均高于同时期其他组织内的表达量,推测猪Fosl2基因可能与肺部组织的发育有关;其在背部脂肪不同发育阶段的变化趋势表明其可能参与调控猪脂肪的生成进而影响瘦肉率。本研究结果将为进一步研究猪Fosl2结构及其多功能奠定基础。 相似文献
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为探究C-C基序趋化因子配体4(C-C motif chemokine ligand 4,CCL4)基因特点及其在藏鸡各组织中表达水平差异情况。以藏鸡作为研究对象,使用RT-PCR技术克隆藏鸡CCL4基因并进行生物信息学分析,然后利用qPCR技术检测CCL4在藏鸡不同日龄不同组织中的表达情况并构建组织表达谱。结果表明:藏鸡CCL4基因长度为633 bp,其中开放阅读框长270 bp,编码89个氨基酸;藏鸡CCL4基因的核苷酸和氨基酸序列与原鸡同源性为100%;CCL4基因在藏鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和腿肌中均有表达,在脾脏中表达量相对较高。该研究为进一步了解CCL4基因的功能和藏鸡的免疫特性提供理论依据。 相似文献
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本研究旨在分析KDM2B在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达规律,为KDM2B在卵母细胞减数分裂及胚胎发育过程中的生物学作用奠定基础。选择20只6～8周龄小鼠为试验动物,收集GV期、MⅡ期卵母细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、囊胚各阶段胚胎,根据GenBank上已公布的小鼠(Mus musculus)KDM2B序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测KDM2B在胚胎各阶段mRNA的表达水平;通过免疫荧光染色定位KDM2B蛋白在胚胎各阶段的分布。结果显示,GV期卵母细胞KDM2B mRNA的表达量极显著高于MⅡ期(P<0.01);在2-细胞、4-细胞和8-细胞mRNA表达量较低,囊胚期其表达量极显著升高(P<0.01);卵母细胞成熟过程中,KDM2B在GV期主要表达于细胞核中,MⅡ期卵母细胞核中的荧光信号极显著减弱(P<0.01),早期胚胎发育过程中,KDM2B蛋白在2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎中均不表达,囊胚期重新表达于细胞核。综上表明,本研究成功建立KDM2B在小鼠卵母细胞及胚胎细胞中的时空及时序表达模式,关于KDM2B参与调控减数分裂与胚胎发育过程具体的作用机制有待进一步研究。 相似文献
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本研究的目的是分离、鉴定牦牛源牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)。将经RT-PCR检测BRV阳性的牦牛腹泻粪便样本接种MA-104细胞,进行病毒分离和鉴定,并对其VP4、VP6和VP7完整基因进行测序,分析其分子特征。结果显示:病毒盲传3代后出现细胞病变,至第7代后出现细胞病变的时间稳定,经蚀斑纯化后测得病毒滴度为108.39TCID50·mL-1。分离株经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察证实为BRV,命名为HY-1株;扩增HY-1株VP4、VP6和VP7完整基因序列,分析表明HY-1株为G6P[11]I2型;系统发育树显示,HY-1株VP4、VP6和VP7节段分别与中国牛源DQ-75株和印度牛源M-1和RUBV319株遗传演化关系最近,可能为重配毒株。与国内的G6型和P[11]型BRV毒株相比,HY-1株的VP4和VP7蛋白重要氨基酸位点变化较大。成功分离得到一株牦牛源BRV,基因型为G6P[11]型,为我国首次报道。 相似文献
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部分地区奶牛腹泻粪便样中诺如病毒的检测和演化分析 总被引：1，自引：1，他引：0
牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)是一种引起犊牛腹泻的病原,目前已在19个国家检出。本研究旨在调查该病毒在国内部分地区的流行情况及分子特征。采用RT-PCR方法检测了5个省12个奶牛场的93份腹泻粪便样本和54份健康粪便样本。结果显示:腹泻样本中BNoV检出率为25.81%,极显著高于健康粪便样本中9.26%的检出率(P<0.01),证明该病毒与犊牛腹泻具有相关性;基于29个RdRp序列的遗传进化分析显示,5份样本为GIII.1型,24份样本为GIII.2型。对获得的18个VP1和13个VP2基因片段的遗传进化分析发现,中国的BNoV毒株具有独特的演化趋势。本研究证明BNoV已在国内的奶牛中广泛流行,是国内犊牛腹泻的新发病原,且国内的BNoV毒株具有独特的演化趋势,为犊牛腹泻的防控提供了重要参考。 相似文献
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检测纽布病毒的Real-time RT-PCR方法的建立与应用 总被引：2，自引：2，他引：0
纽布病毒(nebovirus, NeV)是国内新发的犊牛腹泻病原,本试验目的是建立检测NeV的real-time RT-PCR方法。根据国内NeV流行株的聚合酶基因(RdRp)序列设计引物,通过反应条件和体系优化,成功建立基于TB Green检测NeV的real-time RT-PCR方法。结果显示:该方法在2.9×10~1～2.9×10~9copies·μL-1之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R^2=0.999 4,扩增效率为98%;该方法只特异性检出NeV,不检出常见无关病原;最低检测下限为29 copies·μL-1;批内和批间的变异系数分别为0.89%～1.89%和0.83%～1.15%;该方法对临床样本的检出率高于文献报道的三种检测方法(P<0.05)。对2018年8—11月采自新疆和辽宁的135份奶犊牛腹泻样本中NeV的检出率为67.41%,场阳性率为100%(15/15)。所建方法的特异性和稳定性好、灵敏度高,为NeV的检测和流行病学调查提供了有力的手段。 相似文献
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为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)方法,本研究采用文献报道的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了检测IBRV核酸的iiPCR方法。结果显示该方法仅特异性检测出IBRV,而对牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒3型、牛冠状病毒、牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌等病原则不能检出。该方法的检测下限为2.4拷贝/μL质粒标准品,并具有良好的重复性。对临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法的检测结果一致;该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒,从核酸提取到报告检测结果仅需1h,具有操作简便、快速、可现地化的特点。对9个省29份商品化冻精检测结果显示,IBRV阳性率为24%(7/29),表明我国流通的商品化冻精携带IBRV情况普遍。本研究为IBRV的现地检测提供了一个可靠的方法。 相似文献
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旨在选择小鼠卵巢组织中合适的内参基因,为研究卵巢发育过程中基因表达提供可靠数据。以不同年龄(0日龄、3周龄、5周龄、8周龄)小鼠卵巢组织为试验材料,Trizol法提取样本总RNA,并合成cDNA,根据已报道的小鼠(Mus musculus)各组织中相对稳定表达的8个常见内参基因(Gapdh、β-actin、β-tubulin、18S rRNA、16S rRNA、H2afz、Ubc、Rpl13a)的GenBank登录序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法构建卵巢cDNA等梯度(1∶10)稀释后的标准曲线;利用geNorm分析候选内参基因的表达稳定性(M);NormFinder筛选表达最稳定的内参基因;BestKeeper计算qRT-PCR结果的标准差(SD)和变异系数(CV),从而预测候选内参基因的稳定性。结果表明,8个内参基因的引物特异性较强,具有良好的线性关系;候选内参基因的表达稳定度排序:Gapdh=β-actin>18S rRNA>Ubc>16S rRNA> H2afz>Rpl13a>β-tubulin;其中Gapdh表达稳定性最好,且标准差及方差系数最小(SD:0.32,CV:1.95),H2afz标准差及方差系数最大(SD>1.0,CV:5.76)。综上表明,本研究成功获得出生后小鼠卵巢发育过程中稳定表达的内参基因(Gapdh和β-actin),可作为其基因表达研究中的最佳候选内参。 相似文献
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本调查旨在研究我国不同地区间各种饲料原料中铁含量分布情况,以及我国畜禽基础饲粮中铁含量,从而为饲粮中合理添补铁提供科学依据。采集全国31个省、直辖市和自治区的37种共3 719个主要畜禽饲料原料,经微波消解后,用IRIS IntrepidⅡ等离子体发射光谱仪测定其中铁含量。结果表明:这37种饲料原料的平均铁含量为21.3~2 472.0 mg/kg,而各类饲料原料铁含量平均值分布规律为:矿物质饲料(1 178 mg/kg)>动物性蛋白质饲料(1 030 mg/kg)>牧草饲料(433 mg/kg)>秸秆饲料(404 mg/kg)>谷物籽实加工副产品(260 mg/kg)>植物性蛋白质饲料(181 mg/kg)>谷物籽实饲料(71.2 mg/kg)。通过比较不同省(自治区)的玉米、小麦和豆粕的铁含量发现,不同省(自治区)同一种饲料原料的铁含量均存在显著差异(P<0.05)。根据全国各地猪、鸡常用的142个饲料配方所计算出的基础饲粮中铁含量为70.6~86.1 mg/kg,如按我国猪、鸡饲养标准(2004)或NRC(1994)畜禽铁营养需要量的要求,基础饲粮中总铁含量可提供猪、鸡生长前期约4/5的铁营养需要量,可提供猪、鸡生长后期的铁营养需要量,但上述估算尚未考虑不同饲料原料中铁的利用率。由此可见,不同种类和不同地区饲料原料中铁含量差异较大;全国各地猪、鸡常用的基础饲料配方中总铁含量可提供猪、鸡整个生长期大部分的铁营养需要量。因此,在实际生产中,应充分考虑不同地区基础饲粮中的总铁含量及其利用率,精准配制饲粮,以满足畜禽高效生产的需要,同时减少铁的添加及其排放对环境的污染。 相似文献
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猫传性腹膜炎(FIP)是由猫冠状病毒引起的猫科常见致死性传染病。为分析成都地区猫传性腹膜炎病毒(FIPV)部分基因的序列特征,本研究从11只FIP患猫的腹水中提取总RNA,采用普通PCR或套式PCR对FIPV的非结构蛋白基因ORF3 (3a、3b和3c)、7b以及S基因七肽重复区1 (HR1)序列进行PCR扩增并测序。结果显示:检测到FIRV的上述几个基因均呈遗传多样性,序列存在很大的个体间差异。3a和3b基因主要表现为氨基酸突变,3c基因在约89%的样品中存在截短。7b基因有7个位点的氨基酸被完全替换。S基因HR1序列融合肽的1045位甲硫氨酸被亮氨酸替换,其下游的1057位丝氨酸被丙氨酸替换。遗传进化树显示,本实验扩增的FIRV 7b及S基因HR1序列与GenBank中国外FIPV相应基因序列亲缘性较高。推测3c基因的截短和/或某些氨基酸的替换的共同作用与病毒的致病性有关。本研究结果为FIP的临床确诊提供了分子诊断依据,增加了临床诊断结果的可靠性。 相似文献