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《畜牧与兽医》2014,(8):27-31
2012年2月,潍坊某猪场疑似发生高致病性猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。病猪主要表现为呼吸困难,耳朵发绀,皮肤有弥漫性出血点;剖检发现淋巴结、肺脏出血严重。从病死仔猪脾、肺、淋巴结和脑组织中分离得到病毒。将该毒株在Marc-145细胞上盲传3代出现典型细胞病变,F3代病毒滴度为106.5TCID50/mL。RT-PCR检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性。用F3代毒株进行动物回归试验,结果符合高致病性PRRSV致病特征。上述结果证明该猪场发生的传染病为高致病性PRRS,并且利用Marc-145细胞成功分离到高致病性PRRSV,命名为F株。本研究为高致病性PRRSV致病特点及其疫苗研制提供物质基础。 相似文献
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为分离天津地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)并分析其分子遗传进化关系,对来自该地区某猪场疑似PRRSV感染的样品进行RT-PCR检测,阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs),将出现细胞病变的PAMs进行有限稀释后进行间接免疫荧光鉴定,利用RT-PCR扩增分离纯化株全基因组序列并进行同源性及遗传进化分析,并对分离株进行重组分析和细胞嗜性试验。结果显示,分离获得1株PRRSV毒株(命名为TJbc2021),分离毒株不能感染Marc-145细胞;该毒株全基因组长为15 111 bp,与NADC34的核苷酸同源性最高,为95.2%,属于目前流行于中国的类NADC34 PRRSV,其Nsp2存在100个氨基酸缺失的分子特征;重组分析显示该毒株以谱系1.5毒株(NADC34-like)为主要亲本,以谱系1.8毒株(NADC30-like)为次要亲本,在14 082～14 635 nt(ORF6～ORF7)发生了基因重组。结果表明,分离并鉴定了1株重组类NADC34 PRRSV,可为该地区... 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒GD-ZQ变异株的分离及遗传变异分析 总被引：2，自引：2，他引：0
用RT-PCR方法从某猪场病猪体内分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),命名为PRRSV GD-ZQ株,可致Marc-145细胞病变。细胞分离培育病毒至增殖性能稳定后,分别扩增分离病毒的Nsp2、ORF3、ORF5基因并测序,绘制进化树比较分析遗传进化。结果显示分离毒株的Nsp2、ORF3、ORF5基因序列与美洲型VR-2332、CH-1a等毒株核苷酸序列相似性在89.0%~95.8%之间,与欧洲毒株LV的相似性在48.2%~49.3%之间,遗传进化分析显示该毒株与CH-1a株处于同一分支,分离毒株的Nsp2序列与以HEB1为代表的PRRSV变异株相似性在98.3%~99.4%之间。该病毒在细胞盲传5代能产生稳定规律细胞病变(CPE),且第5代病毒TCID50达10-5.6／0.1 mL。进化分析结果显示GD-ZQ分离株是PRRSV变异株,具有"高热病"PRRSV毒株的变异特点,为了解PRRSV在时间上和分子水平上的遗传变异规律、变异幅度和变异范围奠定基础。 相似文献
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某猪场突发猪高热病后,为确切诊断和弄清病原,采用Marc-145细胞分离病料中的病原,并通过血清中和试验、血凝试验、RT-PCR检测和变异毒株鉴定等方法进行病原鉴定,以及对其ORF7基因和NSP2部分基因开展序列分析。结果表明:从该猪场分离到了1株可使Marc-145细胞产生病变的病毒,其能与美洲型抗PRRSV血清特异性中和,而不与鸡红细胞凝集;RT-PCR检测扩增出了ORF7基因及NSP2部分基因片段;该病毒ORF7基因与PRRSV美洲型毒株VR2332的同源性为93.3%~99.5%,其系统进化树显示它们属同一个大分支;而NSP2基因编码蛋白序列与美洲型毒株VR2332及早期国内分离株比较存在30个氨基酸的缺失。结果说明该猪场高热病病原为高致病性PRRSV变异毒株,且与自2006年以来国内分离的高致病性PRRSV高度同源。 相似文献
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从唐山某猪场患高热病病料中分离到1株病毒,该病毒能在Marc-145细胞上增殖,产生细胞病变。经RT-PCR鉴定证明,该病毒为美洲型PRRSV,将其命名为TS02。应用设计的特异性引物扩增TS02株的Nsp2基因,并与国内外PRRSV分离株的Nsp2基因序列进行了比较。结果表明,TS02株Nsp2基因推导的氨基酸序列出现30个不连续的缺失,与PRRSV高致病性毒株JXA1、GD、WUH1、Jiangxi-3的核苷酸序列同源性分别为97.7%、97.7%、96.5%和97.1%。 相似文献
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将RT-PCR检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)阳性的肺组织碾磨、过滤后接种MARC-145细胞,在细胞上连续传代,上清传至第二代后能产生细胞病变。通过RT-PCR方法可以检测到释放在细胞上清中PRRSV RNA。间接免疫荧光试验也能检测细胞内PRRSV N蛋白的表达,表明该PRRSV毒株成功地在MARC-145细胞中分离,命名为PRRSV NN1396株。对NN1396分离株GP5基因进行克隆测序分析,结果表明该毒株与NCBI登录的PRRSV GP5核苷酸同源性为62.9%~98.2%,与PRRSV原型毒株VR-2332的同源性为87.9%,与高致病性毒株PRRSV JXA1同源性为98.0%,通过GP5的遗传进化分析发现所分离的PRRSV为北美型PRRSV,且与高致病性PRRSV分布在同一个小分支上;对部分nsp2基因的测序、比对结果表明,该部分基因与NCBI登录的参考序列VR-2332氨基酸同源性为73.0%,与JXA1的同源性为94.8%。NN1396分离株Nsp2蛋白含有高致病性PRRSV特异的1+29个氨基酸的缺失,此外,在缺失29个氨基酸区域的上游,含有连续19个氨基酸缺失。该PRRSV毒株的分离和Nsp2蛋白部分序列的缺失鉴定,为下一步研究Nsp2部分氨基酸缺失对病毒生物学特性影响奠定基础。 相似文献
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正猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍及仔猪与育肥猪的呼吸困难为特征的一种传染病。目前PRRSV的诊断方法主要有:病毒分离(VI),RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)等方法。病毒分离耗时长:RT-PCR及IPMA对操作 相似文献
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2013年初上海某猪场保育猪群中出现高热、呼吸障碍等临床表现,导致大部分发病猪死亡,为了确定此次猪群中爆发疫病的病原,本研究从发病猪群中随机采集了15份血液样品,利用RT-PCR方法对本次疫病病原进行了检测。结果显示,有11份临床样品呈现猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)强阳性,且与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)对照大小相一致。随后从阳性样品中选取SHxx13/2013在Marc-145细胞中进行病毒的分离与鉴定,结果显示SHxx13/2013在细胞接种后第1代即出现明显的细胞效应(cytopathic effect,CPE),其病变特征与高致病性PRRSV强毒HuN4株一致。对SHxx13/2013第5代细胞分离毒进行RT-PCR和IFA等特异性鉴定,结果显示该毒株为PRRSV分离株,其蚀斑形态和生长特性与强毒HuN4株相似。分段克隆该毒株全长基因进行测序和序列分析,结果显示,新分离的流行毒SHxx13/2013株全长基因组为15 319 bp,其Nsp2基因特征与HP-PRRSV一致,在第482位和第534~562位发生两处共30个氨基酸的不连续缺失,且该毒株与高致病性PRRSV代表毒株HuN4亲缘关系较近,全长基因的核苷酸同源性为99.6%。本研究结果表明新分离的SHxx13/2013株属于高致病性PRRSV分离株,据此我们推测今年年初上海某猪场爆发的疫情主要是由HP-PRRSV感染所致。 相似文献
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为分离上海地区猪繁殖与呼吸综征病毒（PRRSV）并分析其分子遗传进化关系,对来自该地区某猪场疑似PRRSV感染病猪的2份肺样进行RT-PCR检测,阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs),将盲传3代后出现细胞病变的PAMs经间接免疫荧光鉴定,通过RT-PCR扩增分离株全基因组序列,测序后与GenBank登录的参考株全基因组序列进行同源性及遗传进化分析,分析了分离株Nsp2、GP5氨基酸序列的遗传进化关系,并对分离株做了重组分析和细胞嗜性试验。结果显示,成功分离出1株PRRSV,命名为SH2019,其全基因组开放阅读框大小为14677 bp,分离株与NADC30的核苷酸同源性最高,属于目前流行于中国的类NADC30 PRRSV,其Nsp2存在131个氨基酸缺失的分子特征;分离株是以谱系1毒株为主要亲本,以谱系3、谱系5或谱系8毒株为次要亲本,在12601~12901 nt(ORF2~ORF4)发生了基因重组的重组毒株,分离株不能感染Marc-145细胞。本研究分离鉴定一株重组类NADC30 PRRSV,可为该地区猪繁殖与呼吸综合征的防控提供参考。 相似文献
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为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州PT分离株Nsp2基因序列特征,选择PRRSV JXA1株Nsp2基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出PRRSV贵州PT分离株Nsp2基因片段,克隆至pMD18-T载体并测序,应用DNAStar、PSORTⅡ、TMHMM、MLRC等软件对Nsp2序列的理化参数、同源性、亲水性、表面可及性、抗原性和亚细胞定位等进行分析和预测。结果显示,该基因cDNA长588 bp,蛋白理论分子质量为21.5674 ku,理论pI值为5.02,为不稳定蛋白,具有良好的形成抗原表位的条件。亚细胞定位结果表明该蛋白极有可能位于细胞核,其Nsp2基因与所选18个毒株相应片段的同源性为80.0%~99.8%。预测Nsp2蛋白具有良好的抗原性,在PRRSV的流行过程中,Nsp2基因不断发生遗传变异,产生新的变异序列。 相似文献
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为研究猪蓝耳病病毒(PRRSV)的遗传进化规律,于2018年从新疆某猪场采集的病猪血液中分离了一株PRRSV,命名为XJ-b。对临床样品采用RT-PCR扩增鉴定,将阳性样品过滤处理之后接种在Marc-145细胞系进行培养,将盲传3代之后出现病变(CPE)的Marc-145样品进行间接免疫荧光鉴定。通过噬斑纯化后,利用RT-PCR对分离株的全基因组进行扩增,使用SeqMan软件对测序结果进行拼接,并根据NCBI上已公布的PRRSV全基因组及Nsp2基因核苷酸序列进行遗传进化与同源性比对分析。结果表明,临床病料RT-PCR检测呈PRRSV核酸阳性,处理后的病料接种至Marc-145细胞72 h之后产生CPE,间接免疫荧光鉴定为PRRSV抗原阳性;序列拼接显示分离株全基因组开放阅读框大小为15119 bp;全基因组和Nsp2基因核苷酸序列分析和同源性比对显示该分离毒株属于中国的高致病性PRRSV亚群。研究结果可为近年来新疆地区PRRSV的毒株差异分析提供参考。 相似文献
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一株Nsp2蛋白自然缺失123个氨基酸的PRRSV分离和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
《动物医学进展》2015,(10)
通过RT-PCR方法检测到一份猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性肺组织病料。将该病料研磨、过滤后感染Marc-145细胞,连续传代都能产生明显的细胞病变。为鉴定细胞病变是否由PRRSV引起,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法成功的检测到了PRRSV基因。同时用间接免疫荧光方法证实了感染的细胞内有PRRSV N蛋白的表达。将成功分离的毒株命名为GXYL1403株。对分离株的ORF5基因和Nsp2高变区进行扩增、克隆和遗传进化分析,结果发现该毒株Nsp2高变区与NCBI登录的参考序列VR-2332氨基酸同源性为68.6%,JXA1的同源性为90.8%。通过ORF5遗传进化分析该分毒株为北美型PRRSV,且与高致病性PRRSV分布在同一个小分支上。Nsp2序列对比显示该分离株Nsp2蛋白含有高致病性PRRSV特异的1+29个氨基酸的缺失。特别的是,在缺失29个氨基酸区域的上游,含有连续20个氨基酸缺失,在下游更出现了连续73个氨基酸的缺失。该PRRSV毒株的分离和Nsp2蛋白部分序列的缺失鉴定,为下一步研究Nsp2部分氨基酸缺失对病毒生物学特性影响奠定了基础。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征诊断技术研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
1991年,荷兰中央兽医研究所Wensvoort博士用原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)首次分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),并命名为Lelystad病毒(PRRSV欧洲型代表株).次年,美国科学家Collins和Benfield等用CL2621细胞也分离到一株PRRSV并命名为VR-2332(PRRSV美洲型代表株).PRRSV属于尼多病毒目(Nidovimles)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
采集临床疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料,经处理后进行细胞培养、电镜观察、半数细胞感染量测定、间接免疫荧光试验、动物回归试验以及RT-PCR检测,分离到1株病毒。分离株在Marc-145细胞上连续4代后出现特异性细胞病变;电镜观察到直径50~80 nm的病毒粒子,有囊膜;TC ID50为10-4.7/0.1 mL;与美洲型PRRSV阳性血清进行间接免疫荧光试验可见特征性荧光;RT-PCR检测结果为阳性;回归40日龄血清阴性仔猪可出现PRRSV感染的典型临床症状和病理变化,并且可检测到血清中的特异性抗体。结果表明分离株为PRRSV,命名为PRRSV-SCH07。 相似文献
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PRRSV云南株的分离与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
从云南某猪场采取病料经RT-PCR检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)阳性,将其处理后接种到猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞上。接种后3 d,猪肺巨噬细胞开始出现细胞病变(CPE);Marc-145细胞盲传3代后,细胞也出现了CPE。对出现CPE的细胞培养物,用RT-PCR法、间接免疫荧光试验进行检测,结果均为PRRSV阳性;细胞培养物经PEG初步浓缩后,接种到PRRSV阴性,PRV、CSFV抗体阳性的仔猪,15 d后猪只出现体温升高并伴有食欲减退,精神不振等症状。采血并用同上的RT-PCR法检测,结果为阳性;采血用同上的RT-PCR法检测,结果亦为阳性;用电镜对纯化后的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,其直径约为50 nm;间接免疫荧光实验可见黄色荧光;TCID50测定其毒价为10-4.75/0.1 mL。该病毒对氯仿、紫外线、酸碱度变化(pH5.0或pH7.5)和热敏感;结果表明,已成功分离获得一株PRRSV云南地方流行毒株,命名为YN-1。 相似文献
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采用流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、病毒分离、分离毒株测序以及遗传演化分析的方法,对北京及其周边地区4个猪场剖检的4头猪进行分析。结果:流行病学和临床症状表现为急性高热性传染病;病理学观察为非化脓性脑炎和间质性肺炎等多器官严重的病理变化;RT-PCR和病毒分离确定该疫情的主要病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。与典型PRRSV感染不同的是:成年猪感染率达50%以上,病死率达80%以上;PRRSV分离株全基因序列分析表明属于PRRSV北美洲型,特别是PRRSV NSP2不连续缺失30个氨基酸,说明此次流行的PRRSV毒株可能为高致病性毒株。 相似文献
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从辽宁某猪场采取病料,经处理后接种Marc-145细胞进行PRRSV分离,结果有2份病料在该细胞上盲传后可见典型的CPE,经测定其毒价为10-6.5TCID50/mL。间接免疫荧光试验可见黄色荧光,用电镜对纯化的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,直径约为50~70 nm。该病毒对氯仿、紫外线、酸碱度变化和热敏感。对有CPE的细胞培养物进行RT-PCR,结果为阳性。接种试验动物出现典型的PRRS临床症状和死亡。结果表明,成功分离到一株PRRSV。 相似文献
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为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。 相似文献