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1.
为真核表达传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因,将2007年12月从安徽境内发生的传染性法氏囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡法氏囊组织中克隆的IBDV VP2基因插入到pFastBac1供体质粒中,转化E.coilDH10Bac感受态细胞,经抗性筛选,获得重组杆状病毒表达质粒rBac-VP2,用脂质体法转染SD细胞.对rBac-VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用western blot分析,在50 ku处出现1条特异蛋白条带;电镜观察重组VP2蛋白能够自组装成病毒样颗粒.本实验为研制针对近期流行IBDV的新型病毒样颗粒疫苗和新型检测试剂奠定了基础. 相似文献
2.
《中国兽医学报》2014,(11):1725-1731
为了制备鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒,本试验通过RT-PCR技术扩增出鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株JL株的VP2全长基因,并将其插入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建含有IBDV VP2基因的重组供体质粒pFast-VP2,转化DH10Bac E.coli感受态细胞中,经蓝白斑筛选,获得重组杆粒rBacmid-VP2,将重组杆粒rBacmid-VP2转染sf9细胞后得到重组杆状病毒vBac-VP2。rBac-VP2感染sf9细胞,提取DNA,经PCR电泳分析,得到1条与预期大小相符的特异性条带;间接免疫荧光检测,可见特异性荧光;Western-blotting分析,在大约53 000处出现1条特异性的蛋白条带;电镜观察感染重组杆状病毒的细胞上清和沉淀,均可见重组VP2蛋白自行组装形成的病毒样颗粒。试验结果表明IBDV VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,并自组装成了IBDV病毒样颗粒。本试验为研制鸡传染性法氏囊病病毒样颗粒疫苗奠定了基础。 相似文献
3.
用RT-PCR方法从传染性法氏囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡法氏囊组织AH1与AH2中扩增传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。序列分析结果显示,AH1与AH2病毒VP2基因长度均为1350nt,编码450aa,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.2%、99.3%,七肽基序均为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。进一步将VP2基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-(IBDV)VP2。利用Western-blot、IFA等方法检测IBDVVP2蛋白的体外表达情况,结果证明VP2基因在腺病毒中获得了表达。 相似文献
4.
《畜牧与兽医》2017,(8):88-92
从GenBank下载传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,根据昆虫细胞偏爱密码子对IBDV VP2基因进行密码子优化,化学合成优化后的VP2基因序列,然后构建杆状病毒表达载体pTri Ex-4-VP2,构建成功的重组杆状病毒pTri Ex-4-VP2转染sf9细胞,制备病毒原种,采用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定VP2的免疫原性。结果显示:细胞感染Bac-VP2后,其细胞裂解蛋白在58 ku附近有1个条带,且该条带与IBD阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示VP2基因能在Sf9细胞中表达;动物攻毒保护试验中,2次免疫重组VP2蛋白后能诱导14日龄SPF鸡产生对IBDV强毒攻击,保护率为60%。本研究为进一步研究IBDV VP2基因工程疫苗提供了物质基础。 相似文献
5.
为构建表面展示传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的细菌样颗粒(bacterium-like particies, BLPs),试验分别克隆VP2基因和乳酸乳球菌肽聚糖锚钩蛋白(protein anchor, PA)基因片段,通过融合PCR技术构建VP2-PA融合基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统构建重组杆状病毒rBV-VP2-PA,将表达产物与裸露BLPs共孵育,在PA的介导下,构建表面展示IBDV VP2蛋白的细菌样颗粒(BLPs-VP2);依次采用透射电镜观察、SDS-PAGE、Western-blot、间接免疫荧光对BLPs-VP2进行鉴定。结果表明：VP2蛋白获得成功表达并展示于BLPs表面,可与IBDV阳性血清发生特异性结合,1 U(2.5×109颗粒)BLPs最大可负载约107μg VP2-PA融合蛋白。说明构建的IBDV VP2蛋白BLPs可用于传染性法氏囊病(IBD)新型亚单位疫苗的研发。 相似文献
6.
《中国预防兽医学报》2015,(11)
为表达抗鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体Fab并检测其中和活性,本研究将抗IBDV抗体的轻链(L)和重链片段(Fd)基因分别克隆于p ET-27b(+)载体中,并转化于大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。将L和Fd片段包涵体蛋白变性后等量混合于复性液中,制备Fab并对其进行活性鉴定。结果显示L和Fd蛋白相对分子质量大小分别为25 ku和28 ku。Western blot和ELISA检测结果表明,获得的抗体Fab大小约为50 ku,并且与VP2蛋白和不同病毒株均具有特异性结合能力。体外中和试验结果表明,获得的IBDV抗体Fab具有中和活性,可以有效阻断IBDV(B87株)对鸡胚成纤维细胞(DF1)的感染。本实验获得的IBDV抗体Fab有望成为治疗IBD的候选生物制剂,为研制治疗IBD抗体制剂奠定了基础。 相似文献
7.
鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白GFP融合分子在COS7细胞内的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
将鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2蛋白基因插入增强型绿色荧光表达载体pEGFP-C1中,构建了真核表达载体pEGFP-VP2。PCR与酶切鉴定结果表明VP2基因成功插入到表达载体pEGFP-C1中。脂质体法转染COS7细胞后,荧光显微镜检测到了GFP-VP2融合蛋白的表达。用200 μg/ml的G418成功筛选到了稳定表达GFP-VP2融合蛋白的细胞系,表达蛋白经镍亲和柱得到了纯化。 相似文献
8.
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《中国预防兽医学报》2016,(10)
传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种高度危害养鸡业的传染病。肿瘤抑制蛋白p53能够抑制多种病毒的复制,但对IBDV复制的影响仍然不清楚。本研究以IBDV为模式病毒,采用体外感染模式,在IBDV感染的DF-1细胞中,p53的表达水平和活性均显著升高。p53过表达可以抑制IBDV的复制,并激活鸡体抗病毒天然免疫基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的表达水平上调;抑制p53的表达则得到相反的结果;表明p53可以激活鸡体的抗病毒天然免疫反应发挥抗IBDV感染作用。利用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析发现,gga-miR-2127可以作用于p53 mRNA的3'UTR;荧光定量RT-PCR和免疫印迹分析表明gga-miR-2127可以使p53的蛋白水平表达降低,但mRNA水平没有变化;gga-miR-2127过表达可以使鸡体的抗病毒天然免疫基因表达降低,IBDV复制水平升高。本研究表明:gga-miR-2127可以作用于p53 mRNA的3'UTR调控p53的表达从而影响其下游抗病毒天然免疫基因的表达来发挥抗IBDV感染的作用。 相似文献
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传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
11.
为获得可用于鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体检测的重组抗原VP2蛋白,根据GenBank中发表的IBDV VP2序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV经典标准攻毒株(BC6/85株)的VP2基因,插入质粒pET-32a中构建重组表达质粒pET-32a-VP2,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western-blot检测表明具有良好的反应原性。本研究为下步建立IBDV抗体的间接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
12.
为提高重组新城疫病毒(NDV)外源基因表达量,本研究采用内部核糖体进入位点序列(IRES)构建表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV) HLJ07株VP2双拷贝基因的重组NDV(rClone30-VP2-IRES-VP2),同时构建表达单拷贝VP2基因的重组NDV (rClone30-VP2)作为对照.间接免疫荧光试验表明VP2蛋白在感染两种重组病毒的鸡胚成纤维细胞(DF-1)中得到表达.Real-time PCR检测结果表明rCIone30-VP2-IRES-VP2中VP2 mRNA转录水平明显高于rClone30-VP2.生长曲线分析表明,两株重组病毒株与亲本NDV LaSota (Clone30)株在细胞培养中可以同样稳定复制.重组病毒株在鸡胚中多次传代之后仍稳定表达VP2蛋白.本研究通过建立NDV的反向遗传操作系统构建了独立表达IBDV双拷贝VP2基因的重组NDV,并证明双拷贝基因的表达水平优于单拷贝基因,为提高重组NDV外源基因的表达量提供了新的思路. 相似文献
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将两株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）弱毒株在SPF鸡体内连续传代至第5、第6代时,出现明显的法氏囊萎缩和B：B指数下降,表明IBDV弱毒株在鸡体内连续传代后毒力增强。为进一步阐释哪些基因位点导致了上述毒力的变化,本试验测定了基础弱毒株及其在鸡体内传代后各个代次毒的基因组序列,比对分析后发现VP2蛋白253位氨基酸发生了由H到Q或N的变异,表明VP2蛋白253位氨基酸的替换可能会增强传染性法氏囊病病毒在鸡体内的致病性。 相似文献
15.
为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。 相似文献
16.
传染性法氏囊病（infectious bursal disease virus,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种主要危害雏鸡的急性传染病。在IBDV编码的5个蛋白中,VP5是IBDV唯一可以缺失基因的蛋白。本研究克隆了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白编码基因,利用原核表达系统表达了VP5蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备VP5多抗,并对多抗进行了鉴定和检测不同IBDV毒株的应用。结果显示,IBDV优势流行毒株的VP5蛋白实现了可溶性表达,分子质量约为17 kDa;制备的VP5多抗特异性良好,ELISA效价可达1:64 000;VP5多抗可通过IFA和Western Blot检测识别IBDV rHLJ0504-HT株,不识别VP5基因缺失株。结果表明：试验成功表达了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白,并制备了VP5多抗;VP5多抗可对IBDV及其VP5编码基因缺失毒株进行鉴别检测。本研究对于IBDV检测方法的建立以及VP5编码基因功能的进一步研究提供了物质基础。 相似文献
17.
《畜牧与兽医》2021,(6)
为了研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒样颗粒(VLP)的免疫原性,通过RT-PCR扩增其VP2基因,克隆到pSYno-1原核表达载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行表达。通过烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus, TEV)蛋白酶酶切后制备VLP并进行免疫原性分析。结果显示:His-MBP标签能够促进VP2蛋白的可溶性表达,其可溶性表达水平约为50%;透射电镜观察发现TEV蛋白酶切开的VP2能形成25 nm左右的VLP;动物试验结果发现VLP免疫能诱导产生较高的抗体水平,并能保护免疫鸡抵抗IBDV强毒攻击,其中免疫组脾体比显著低于非免疫组(P0.05),免疫组血清和组织中病毒含量极显著低于非免疫组(P0.01),表明VLP具有良好的免疫原性。本研究为IBDV基因工程疫苗的研发提供了参考。 相似文献
18.
应用RT-PCR方法从鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)JS株中扩增出VP2基因,并克隆入T-easy载体。序列测定分析结果表明IBDVJS株的VP2基因与国际标准强毒株的核苷酸序列同源性达98%,氨基酸序列同源性达99%以上。随后将VP2基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1/zeo( ),构建成功真核表达质粒pcD-VP2,pcD-VP2体外转染COS-1细胞,能在COS-1细胞中表达。利用pcD-VP2质粒进行动物实验,结果表明雏鸡免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,pcD-VP2的真核表达质粒二次免疫诱导鸡产生对IBDV强毒攻击的保护率为67%,这一结果提示VP2基因具有重要开发应用价值。 相似文献
19.
为建立敏感、特异、稳定的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法,本试验以杆状病毒表达系统表达的重组IBDV-VP2结构蛋白为抗原,通过包被VP2单克隆抗体捕捉VP2结构蛋白的形式,建立鸡血清VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法(VP2-ELISA)。条件优化结果显示:单克隆抗体最适包被质量浓度为3mg/L,VP2最佳稀释度为1∶20,夹心ELISA效价1∶12.8,被捡血清的稀释度为1∶400。该方法与禽流感、鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性喉气管炎病毒及杆状病毒阳性血清无交叉反应,对琼扩效价为1∶32的IBDV阳性血清的最低检出量为1∶12 800,ROC曲线确定的D450nm临界值为0.236,组内、组间重复性试验变异系数均小于10%。用本试验建立的VP2-ELISA方法与进口IBDV-ELISA抗体试剂盒平行检测100份背景已知的临床鸡血清样品,总符合率VP2-ELISA(97%)高于进口ELISA试剂盒(96%)。本试验为进一步研制鸡传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒奠定基础。 相似文献
20.
传染性法氏囊病病毒VP2基因在家蚕中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
传染性法氏囊病病毒（IBDV）能引起以淋巴细胞衰竭为特征的抑制性疾病。IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，在VP2上的点突变是造成IBDV抗原漂变的主要原因。为研究VP2作为IBDV亚单位疫苗的潜力，本实验将IBDV JD1株的VP2基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，将重组载体pBacPAK-VP2与病毒Bm-Bac-PAK6的线性化DNA共转染家蚕培养细胞，获得重组病毒BacPAK-VP2。DIG点杂交表明重组病毒基因组中含有VP2基因。重组病毒感染家蚕5龄幼虫后，用ELISA、SDS－PAGE和Western blotting检测蚕血淋巴中重组VP2蛋白的相对表达量及免疫反应性。结果表明重组VP2蛋白具有免疫反应性，感染后5－6d在蚕血淋巴中的表达量最高。 相似文献