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应用氯化铭密度梯度离心技术，结合Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ试验、￣（３２）Ｐ标记的鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）ＤＮＡ探针进行斑点杂交试验，从ＤＨＢＶ阳性的启东鸭血清中分离得到高纯度的ＤＨＢｓＡｇ颗粒，直径范围４０～６０ｎｍ，在ＣｓＣｌ溶液中的浮密度为１．１５ｋｇ／Ｌ，大多数呈１０ｎｍ厚的空心结构，形态不规则，近似球形，部分颗粒表面有凹陷结构，少数颗粒表面出现缺刻。以纯化的ＤＨＢｓＡｓ免疫新西兰大白兔，制备了高度特异性的兔抗ＤＨＢｓ血清及其纯化的兔抗ＤＨＢｓＩｇＧ。 相似文献
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等电聚焦分析兔出血症病毒多肽 总被引：1，自引：1，他引：0
人工感染ＮＪ株ＲＨＤＶ病毒死兔肝经低温反复冻融,氯仿处理,ＰＥＧ沉淀、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ柱层析得纯化病毒。纯化病毒经尿素－聚丙烯酰胺圆盘等电聚聚焦,考马斯亮蓝染色紫外扫描显示８条多肽,其等电点及相对百分含量分别为Ａ：６．３,１８,５１％;Ｂ＝６．７,１１．２２％;Ｃ：７．４％;Ｄ：７．７,８．５３％;Ｅ：８．１,７,２７％Ｆ：８．７,１２．４４％Ｇ：９．０。１６,１８％,Ｈ：９．５,２２．２ 相似文献
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不同方法提取鸡血清IgG及纯度鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
本文用Ｎａ_２ＳＯ_４和（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４两种盐沉淀鸡血清ｒ－球蛋白，再经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２００柱和ＤＥＡＥ－３２柱进一步纯化，将获得的ＩｇＧ利用免疫电泳和聚丙烯酰胺凝胶（ＰＡＧＥ）电泳进行纯度鉴定，结果表明：在本试验条件下，盐析方法获得的ｒ－球蛋白经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２００柱分离获得高纯度的鸡ＩｇＧ，ＤＥＡＥ－３２柱经０．１ＭＰＢＳ（ＰＨ７．４）洗脱，２ＭＮａＣｌ解离获得的ＩｇＧ纯度较差。 相似文献
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以３０％ ～６０％ 硫酸铵饱和度分级沉淀、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ 和羟基磷灰石层析纯化了小麦５－氨基酮戊酸脱水酶（ＡＬＡＤ）,其在ｐＨ ８．５ 时比活为３１ Ｕ·ｍ ｇ－ １蛋白;酶纯化了９１ 倍,得率５％ ,酶亚基分子质量约５２ ｋｕ,全酶分子质量约３３０ ｋｕ,表明酶由６ 个亚基组成;酶的等电点为４．８,在４００ ｎｍ有吸收峰,最适反应温度４５℃,Ｍｇ２＋ 激活酶,Ｚｎ２＋ 和磷酸吡哆醛抑制酶。纯化的ＡＬＡＤ浓缩后,－ ２０℃下在０．１ ｍ ｏｌ·Ｌ－ １,ｐＨ ８．５ 的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ,内含５０％ 的甘油,５ ｍ ｍ ｏｌ·Ｌ－ １的巯基乙醇和ＭｇＣｌ２ 中黑暗贮藏３０ ｄ 酶活不损失 相似文献
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ＵＶ－Ｂ辐射对农垦５８ｓ某些生理特性和育性的影响李合生１）岳兵１）曾汉来１）戴秋杰２）（１）华中农业大学农学系，武汉４３００７０；２）江苏省农科院，南京２１００１４）ＥＦＦＥＣＴＯＦＵＶ－ＢＲＡＤＩＡＴＩＯＮＯＮＳＯＭＥＰＨＹＳＩＯＬＯＧＩＣＡＬＣＨ... 相似文献
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蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体研制 总被引：2，自引：0，他引：2
用蚕豆萎蔫病毒提纯病毒粒子免疫ＢＡＬ Ｂ／ｃ小鼠,取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,用纯化的ＢＢＷＶ病毒对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经三次有稀释法克隆,成功获得了２株ＢＢＷＶ特异性单克隆抗体的细胞株,分别命名为４Ｄ１１,３Ｇ１２．２株单抗腹水间接ＥＬＩＳＡ效价高达１：６４００００,抗体类型均为ＩｇＧ１,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明,２株单抗均是针对ＢＢＷＶ ４４．７ｋＤ的外壳蛋白 相似文献
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蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体研制 总被引：14，自引：3，他引：11
用蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）提纯病毒粒子免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,用纯化的ＢＢＷＶ病毒对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经三次有限稀释法克隆,成功获得２株ＢＢ－ＷＶ特异性单克隆抗体的细胞株,分别命名为４Ｄ１１,３Ｇ１２．２株单抗腹水间接ＥＬＩＳＡ效价高达１∶６４００００,抗体类型均为ＩｇＧ１,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ分析表明,２株单抗均是针对ＢＢＷＶ４４．７ｋＤ的外壳蛋白大亚基的特异性抗体．单抗抗原结合位点分析表明４Ｄ１１和３Ｇ１２两单抗作用于同一抗原决定簇 相似文献
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应用氯化铯密度梯度离心技术，结合Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ试验，３２Ｐ标记的鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）ＤＮＡ探针进行斑点杂交试验，从ＤＨＢＶ阳性的的启东鸭血清中分离得到高纯度的ＤＨＢｓＡｇ颗粒，直径范围４０－６０ｎｍ，在ＣｓＣｌ溶液中的浮密度为１．１５ｋｇ／Ｌ大多数呈１０ｎｍ厚的密心结构，形态不规则，近似球形，部分颗粒表面有凹陷结构，少数颗粒表面出现缺刻。以纯化的ＤＨＢｓＡｇ免疫新西兰大白兔，制备了高度特 相似文献
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经反应红１２０亲和层析纯化的小麦胆色素原脱氨酶（Ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ ｄｅａｍｉｎａｓｅ,ＰＢＧＤ,ＥＣ．４,３,１,８）,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＩＥＦ－ＰＡＧＥ上均显示一条带,表明已ＰＢＧＤ纯化至均一,它的亚基分子量３６ＫＤ,ｐＩ为４．８。酶活性染色呈一条带,表明无同工酶存在。ＰＡＧＥ显示两条带,证明小麦幼苗中存在酶与底物结合的中间物。脲梯度电泳呈现之字形,在４ｍｏｌ／Ｌ的脲浓度下可使酶 相似文献
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兔病毒性出血症研究进展及其在国际上的评价 总被引：5，自引：0，他引：5
徐为燕 《南京农业大学学报》1994,17(3):47-52
兔病毒性出血症是中国首先报道的一种毁灭性传染病。此病在各种病名下遍及欧洲大部分地区，但均无病原特征的描述。兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）是一种新发现的病毒，直径３２～３４ｎｍ，二十面体对称，无囊膜，存在于感染细胞的核和胞浆内。它对酸（ｐＨ３）、热（６０℃）、乙醚（２０％）和ＭｇＣｌ２（１ｍｏｌ／Ｌ）有坚强的抵抗力。在ＣｓＣｌ中的浮密度为１．３６～１．３８ｇ／ｃｍ２；在蔗糖梯度中的沉降系数为１６２Ｓ。它能凝集人红细胞，滴度可达１０×２１８以上。在细胞培养中很难适应。核酸为线状单股ＤＮＡ，末端有发夹结构。用体外合成的双股ＤＮＡ，取其酶切片段插入ＢＳ质粒后，转化ＤＨ大肠杆菌。从重组质粒提取的２个片段（ｐＹＣ－２和ｐＹＣ－９）以同位素或光敏生物素标记后，能与ＲＨＤＶ和一部分细小病毒杂交。在诊断中最有效的血清学试验为ＨＡ－ＨＩ和ＥＬＩＳＡ。灭活疫苗效果确实，已为所有发病各国所证实。根据以上特征，ＲＨＤＶ被认为是一种细小病毒样病毒，但欧洲学者持不同看法。 相似文献
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为探讨圆小囊在免体全身抗感染免疫中的功能作用，采用组织病理学及免疫组织化学方法，对比观察了2日龄、1月龄及2月龄实验免感染RHDV后圆小囊的病理变化，同时采用ELISA方法对实验兔的血清及肝、肾、脾中的RHDV含量进行了测定，重点对实验兔圆小囊黏膜上皮内淋巴细胞(IEL)进行了统计比较，结果显示：2月龄以内兔人工感染RHDV后，临症表现、剖检及组织病理学观察均未见异常。血清及RHDV的靶器官肝、脾、肾中均未检测出RHDV抗原。2月龄以上兔感染RHDV后，无论从临床症状，还是大体剖检，组织病理学观察，均出现了明显的病理学改变，而且感染后血清RHDV抗原检测呈阳性反应。圆小囊、肝、脾、肾等组织器官都呈现RHDV免疫组化强阳性反应。2月龄以内的乳兔及仔兔感染RHDV后，圆小囊虽未出现明显的形态结构改变，免疫组化染色也未见RHDV抗原阳性反应物，但IEL明显增多，2日龄兔IEL由1．2％增加到4．2％；1月龄兔的IEL由10．1％增加到26．1％。1月龄仔兔还表现出固有层中淋巴细胞明显增多。 相似文献
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原核表达的兔出血症病毒衣壳蛋白对兔的免疫保护效果 总被引：4，自引：0，他引：4
为了检验大肠杆菌表达的兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白（VP60）对兔的免疫保护效果，将34只清洁兔随机分成3组：单用免疫佐剂对照组（8只）、单用重组VP60组（8只）和重组VP60加免疫佐剂组（18只），分别经皮下注射，VP60的免疫剂量为每只每次400 μg，免疫2次，间隔7 d。在第2次免疫7 d后，VP60加免疫佐剂组的兔血清抗体水平显著高于单用VP60免疫组（ELISA 1∶64 000 对比1∶4 000 / HI 1∶128 对比1∶16），表明免疫佐剂可明显加速重组VP60诱导抗体产生的进程，用RHDV NJ85强毒攻击，免疫佐剂对照组与单用VP60免疫组的实验兔均全部死亡（8/8和8/8），VP60加免疫佐剂组均全部存活，保护率为100%（18/18）。用RHDV血凝试验（HA）检测，死亡兔的肝脏组织液HA效价大于1∶512，而存活兔的肝脏组织液HA效价小于1∶2，肝脏组织触（涂）片检查和细菌培养均为阴性，证明病死兔系RHDV感染所致。用RHD重组亚单位疫苗在养兔场进行800只兔的田间免疫试验，安全有效，没有出现不良反应。对重组菌进行冻存、复苏、培养、诱导表达和质粒酶切分析，证明VP60基因在宿主菌内保持稳定。 相似文献
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通过RT-PCR方法扩增上海地区兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白基因(VP60).将其克隆入腺病毒表达载体系统中,构建成重组腺病毒质粒,用脂质体法转染HEK293细胞,得到重组病毒pAd-VP60,经RT-PCR、IFA、HA、SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,结果表明重组VP60蛋白在HEK293细胞中获得表达.表达产物与铝胶佐剂混合后注射3月龄非免疫健康家兔,结果表明,免疫后21 d兔体内产生抗RHDV抗体,其HI效价可达2~6～2~7,能抵御HA≥2~(10)致死剂量RHDV强毒的攻击,保护率为100%. 相似文献
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采用Bac-to-Bac系统表达的兔出血症病毒(RHDV)结构蛋白VP60作为包被抗原,建立抗体检测间接ELISA方法,并对方法性能进行测定。试验以整合有VP60基因的重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞,感染细胞经裂解、离心初步纯化,作为包被抗原建立了检测RHD抗体的间接ELISA方法。经过对反应条件和试剂的优化选择,初步组装成间接ELISA试剂盒,并对其整体性能进行了评价。结果表明,含重组VP60蛋白的Sf9细胞裂解液最适包被稀释度为1:2000,换算为纯化VP60蛋白含量约为1.7μg·mL-1;待检血清最适稀释度为1:100;羊抗兔IgGHRP标记抗体最适使用浓度为1:30000。初步组装的ELISA试剂盒检测RHD阴性血清无假阳性反应,与其他常见兔病阳性血清无交叉反应,特异性良好;敏感性高于RHDV全病毒间接ELISA和血凝抑制试验,低于进口间接ELISA试剂盒;试剂盒批内和批间变异率在10%以内。37℃加速破坏试验和4℃保存期试验结果表明试剂盒保存期可以稳定在6个月。该方法可应用于兔出血症抗体水平监测及实验兔等级检测中。 相似文献
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用RHDV人工感染易感兔,每隔4小时剖杀一组,整个病程大多为24小时,且病变典型.血凝试验查得,主要脏器病毒出现时间顺序是肝(攻毒后12小时)、脾、心、肾(16小时)、肺(20小时);病程后期,病毒含量从高到低依次为肝、脾、肺、肾、心。免疫荧光间接法检查感染兔各脏器,发现病毒经肌注兔体后4小时,即可定位于肝细胞,并在肝细胞核内复制增殖;兔感染病毒后16小时,在肝、脾、肾小球中可检出有免疫复合物沉着或抗体附着。电镜检查,肝细胞核内发现有病毒粒子,直径为25～30nm,细胞结构破坏严重。作者认为,RHDV 是一种 DNA 病毒;免疫复合物引起的免疫损伤及肝细胞结构、功能被破坏是兔发生病毒性出血症的重要原因。 相似文献
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兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究兔出血症病毒（RHDV）VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b（＋）为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。 相似文献
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以不同日龄及生理状态下的中国白兔为试验动物,经静脉接种、皮下接种、滴鼻和同居感染兔出血症病毒,进行临床检查和病理学观察。结果表明,静脉接种感染的兔潜伏期比其他途径感染的兔短;2月龄以下幼兔有明显的抵抗力,其他月龄的兔均易感,怀孕兔全部发生流产;临床病理学观察以各实质器官的退行性病变及弥散性血管内凝血为主要特征,表现为各组织器官严重出血、水肿,实质细胞广泛性变性、坏死,微血管内大量血栓形成、炎性细胞浸润等。 相似文献
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对人工感染兔出血症病毒的淋巴－网状器官进行组织病理学、超微结构及免疫组织化学的动态研究。结果表明；（１）各淋巴－网状器官出现网状细胞、巨噬细胞及浆细胞反应性增生的免疫应答反应及淋巴细胞损伤性变化，主要表现为淋巴滤泡萎缩、出血及局灶性淋巴细胞或网状细胞的坏死。（２）各淋巴－网状细胞出现程度不同的细胞病理效应（ＣＰＥ），尤以胸腺和圆小囊较明显，初期表现为线粒体肿胀和内质网空泡化，进入濒死期时，表现为淋巴－网状细胞的坏死。（３）该病毒对淋巴－网状细胞有亲嗜性，证明病毒可直接侵害淋巴－网状器官，引起免疫缺陷，从而促使本病的发生。 相似文献
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兔出血症病毒套式PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank登录的兔出血症病毒的VP60基因序列，设计了2对引物，建立了检测兔出血症病毒的套式PCR检测方法．先用外引物扩增一段389bp的DNA片断，继而用内引物以扩增产物为模板进行第2次扩增（即套式PCR），以提高结果的准确性，避免一次性PCR的假阳性结果．用该方法对12份RHD样本进行检测，检出率为100％． 相似文献