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N Ikuta J El-Attrache P Villegas E M García V R Lunge A S Fonseca C Oliveira E K Marques 《Avian diseases》2001,45(2):297-306
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Tiwari AK Kataria RS Indervesh Prasad N Gupta R 《Comparative immunology, microbiology and infectious diseases》2003,26(1):47-53
In order to differentiate infectious bursal disease virus (IBDV) isolates/strains, a quick method of RT-PCR followed by restriction enzyme analysis of VP1 gene sequence is being reported for the first time. A 480 bp fragment, comprising one of the RNA dependent RNA polymerase motifs of VP1 gene sequence of an Indian classical virus, an attenuated vaccine strain, Georgia and two Indian field isolates, genetically similar to reported very virulent strains of IBDV, was amplified by RT-PCR. Restriction enzyme digestion of PCR products with Taq1 enzyme generated distinct profile for field isolates, different from the classical and attenuated viruses, whereas restriction profile with BstNI restriction enzyme was similar in all the viruses, irrespective of the pathotype. Therefore, the present results suggest that Taq1 digestion can be taken up for the differentiation of field isolates from the classical and vaccine strains. The sequence analysis of VPI gene of reported very virulent IBD viruses from Europe and Japan, using 'MapDraw' programme of Lasergene software, revealed similar restriction enzyme profile as in Indian field isolates. 相似文献
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用RT-PCR方法从传染性法氏囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡法氏囊组织AH1与AH2中扩增传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。序列分析结果显示,AH1与AH2病毒VP2基因长度均为1350nt,编码450aa,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.2%、99.3%,七肽基序均为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。进一步将VP2基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-(IBDV)VP2。利用Western-blot、IFA等方法检测IBDVVP2蛋白的体外表达情况,结果证明VP2基因在腺病毒中获得了表达。 相似文献
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应用RT-PCR方法从鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)JS株中扩增出VP2基因,并克隆入T-easy载体。序列测定分析结果表明IBDVJS株的VP2基因与国际标准强毒株的核苷酸序列同源性达98%,氨基酸序列同源性达99%以上。随后将VP2基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1/zeo( ),构建成功真核表达质粒pcD-VP2,pcD-VP2体外转染COS-1细胞,能在COS-1细胞中表达。利用pcD-VP2质粒进行动物实验,结果表明雏鸡免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,pcD-VP2的真核表达质粒二次免疫诱导鸡产生对IBDV强毒攻击的保护率为67%,这一结果提示VP2基因具有重要开发应用价值。 相似文献
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传染性法氏囊病病毒VP2/VP0基因在重组鸡痘病毒中的表达 总被引：3，自引：1，他引：2
以鸡痘病毒复制非必需区ＴＫ基因为侧翼,在牛痘病毒Ａ型包涵体晚期启动子（ＡＴＩ）与１６个串联的突变型早期痘苗病毒ｐ７．５启动子组成的复合启动子的下游,分别插入编码传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）结构蛋白ＶＰ２和ＶＰ２－４－３（ＶＰ０）的基因片段后,进行了同源重组和蓝斑筛选,获得２株重组病毒ｖＵＴＡＬａｃＶＰ２－７和ｖＵＴＡＬａｃＶＰ０－１０。经ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明,重组病毒ｖＵＴＡＬａｃＶＰ２－７能表达ＶＰ２,ｖＵＴＡＬａｃＶＰ０－１０能表达ＶＰ２和ＶＰ３,ＶＰ２和ＶＰ３的Ｍｒ分别为４１０００和３２０００。 相似文献
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鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。 相似文献
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传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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为获得可用于鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体检测的重组抗原VP2蛋白,根据GenBank中发表的IBDV VP2序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV经典标准攻毒株(BC6/85株)的VP2基因,插入质粒pET-32a中构建重组表达质粒pET-32a-VP2,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western-blot检测表明具有良好的反应原性。本研究为下步建立IBDV抗体的间接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基础。 相似文献