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1.
[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。 相似文献
2.
[目的]构建犬黑皮质素受体4（MC4R）突变体D90N真核表达载体,并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板,应用重叠PCR扩增MC4R突变体D90N目的基因,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N经酶切和测序鉴定;采用FuGENEHD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72.0h,提取细胞内总RNA,用RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,用WesternBlot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N重组真核表达载体,测序结果显示含有D90N突变位点。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N,重组体能在MD-CK细胞中表达。 相似文献
3.
ETR1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]构建拟南芥乙烯受体(ETR1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体。[方法]从ETR1基因cDNA序列上选取目标序列,设计2对引物,经PCR扩增得到正反向2个DNA片段(S5I和AI),构建含有该正反向互补重复序列DNA片段的中间载体,测序分析正确后再克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中的Gus位置并经双酶切证实。[结果]ETR1基因S5I和AI片段被成功克隆进质粒pCAM-BIA1301中,酶切鉴定及测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片段的序列完全一致。[结论]ETR1靶向RNA干扰重组体的成功构建,为进一步获得拟南芥乙烯受体基因的功能缺失突变体奠定良好基础。 相似文献
4.
[目的]构建犬黑皮质素受体4真核表达载体并在COS-7细胞中进行瞬间表达。[方法]以犬MC4R线性DNA为模板,进行引物设计,PCR特异性扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)。重组体pcD-NA3.1(+)-MC4R经过酶切和测序鉴定。采用FuGENE HD介导转染技术将pcDNA3.1(+)-MC4R导入COS-7细胞,提取细胞内总RNA,RT-PCR扩增犬MC4R基因的全长cDNA编码序列。[结果]克隆犬MC4R基因的全长cDNA序列,并以pcDNA3.1(+)表达载体为骨架,构建真核表达载体,测序的扩增片段与GenBank公布的模板序列经Blast比对相似性为99%。采用G418筛选,获得带有pcDNA3.1(+)-MC4R的COS-7细胞。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1(+)-MC4R,重组体能在真核细胞中表达。 相似文献
5.
目的:克隆结核分枝杆菌Rv3872与Rv3873基因,并构建Rv3872与Rv3873基因的重组真核表达载体,为研究这2个基因的功能奠定实验基础。方法:利用PCR技术克隆Rv3872与Rv3873基因序列,将其连接至pMD-18T载体,鉴定成功后将Rv3872与Rv3873序列插入真核表达载体pEGFP-C1,构建重组pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体,并进行质粒PCR、双酶切以及测序验证。结果:经测序比对后,Rv3872与Rv3873序列与Gene Bank中公布的基因序列一致,重组载体构建成功。结论:成功构建重组pEG-FP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体。 相似文献
6.
为在真核细胞中表达牛乳头瘤病毒2型(BPV2)衣壳蛋白L1基因。采用PCR方法从奶牛皮肤肿瘤病料中扩增BPV2沙湾分离株L1基因,克隆入pMD18-T载体中,测序后进行序列分析。以pcDNA 3.1(+)为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入BHK-21细胞,通过间接荧光免疫试验检测BPV2-L1蛋白的表达。本研究成功构建pcDNA3.1(+)-BPV2-L1重组真核表达质粒,证实能表达出BPV2-L1蛋白,为BPV2DNA疫苗的研发提供了前期基础。 相似文献
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构建硬酯酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA Desaturase l,SCD1)真核表达质粒pcDNA3.1(+)/SCD1,转染鹅原代肝细胞验证其对细胞中脂肪代谢的影响。根据鹅SCD1基因设计带有酶切位点引物,RT-PCR扩增SCD1基因,克隆至pMD-19T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,构建重组真核表达载体pCDNA3.1(+)/SCD1。酶切及序列测定测序正确后转染鹅原代培养肝细胞,荧光定量PCR检测SCD1基因的表达,并用油红O染色检测细胞中脂滴情况。结果:成功构建SCD1基因真核表达载体,转染鹅原代培养肝细胞后SCD1基因获得了表达,与脂肪代谢相关基因SREBP表达上调,同时检测到细胞中脂滴明显增多。结论:构建了重组质粒pCDNA3.1(+)/SCD1,并在鹅原代培养细胞中获得表达,为进一步研究SCD1基因在鹅肝脏脂肪代谢中的作用奠定基础。 相似文献
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克隆新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Roakin株HN基因,并构建真核表达载体.应用RT-PCR扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,并进行了测序鉴定和HN基因的序列分析.然后分别将NDV的HN基因和选择标记基因-二氢叶酸还原酶(dhfr)基因插入到真核表达载体pCI-neo中,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析等鉴定所构建的重组真核表达载体.RT-PCR扩增的NDV Roakin株HN序列与GenBank中标准毒株(登录号AY289000)HN序列同源性为99.8%,构建了HN基因的真核表达质粒pCI-HN-D.成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体. 相似文献
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为构建牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,根据GenBank牛瑟氏泰勒虫p23表面蛋白基因序列（D84447）,分别设计2对特异性引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取牛瑟氏泰勒虫基因组DNA,采用SOE—PCR技术构建双拷贝p23基因,克隆到pMD-18-T载体上,经过PCR、酶切鉴定及测序后,亚克隆到pVAX-Ⅰ真核表达载体上,经过鉴定后采用脂质体法将重组质粒pVAXI-2p23转染到BHK-21细胞,用IFA和RT—PCR来鉴定目的基因的表达情况．结果表明,成功构建了牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中获得表达． 相似文献
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以双元质粒pBI121为基础分别构建正义、反义和RNA干涉(RNAi)植物表达载体根据pBI121质粒多克隆位点两侧的DNA序列设计1对通用引物,以表达栽体的重组质粒DNA为模板进行PCR扩增,使用限制性内切酶BamH Ⅰ酶切PCR产物以验证扩增条带的真实性,从而可以快速鉴定pBI121表达栽体的重组克隆这种方法也可用于快速鉴定上述表达载体的转基因植株,其检测结果与常规鉴定方法完全一致此外,可以根据需要对表达载体的阳性PCR扩增产物进行测序,测序结果能够精确地显示出重组pBI121表达栽体中目的片段的插入方向以及插入序列是否出现碱基突变本研究为各种pBI121表达载体及其转基因植株的鉴定提供了一种快速、有效的方法 相似文献
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选择对赤霉病菌具有高度特异性和亲合力的单链抗体,与植物防御素构建成融合蛋白基因,将融合蛋白及防御素基因分别与细菌表达载体pGEX和植物表达载体pMBL4构建成重组载体,在细菌中经IPTG诱导表达GST融合蛋白,亲和层析纯化蛋白;经根癌农杆菌介导的真空渗入法在烟草叶片中瞬间表达,提取叶片总蛋白用于鉴定。抑菌活性分析表明,烟草叶片瞬间表达的防御素和抗体-防御素融合蛋白,均对赤霉病菌有强烈的抑菌作用;从细菌中纯化的防御素蛋白,也能有效抑制赤霉病菌生长。说明赤霉病菌抗体-防御素融合蛋白基因,可作为抗赤霉病资源,用于改良植物的抗赤霉病性。 相似文献
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[目的]研究家蚕微孢子虫对果蝇的侵染性,为系统研究家蚕微孢子虫侵染机制提供新视野,也为探索微孢子虫的生物防治效果提供参考。[方法]用家蚕微孢子添食野生型和突变型果蝇,并用Calcofluor White M2R荧光染色法进行果蝇体液内的家蚕微孢子虫形态观察。[结果]结果表明,家蚕微孢子虫在转宿主情况下能够侵染果蝇,且被感染的突变型果蝇体内家蚕微孢子虫的数量多于野生型果蝇。[结论]家蚕微孢子虫能侵染果蝇,该研究结果为研究家蚕微孢子虫侵染其他宿主提供了初步参考,为进一步了解和认识家蚕微孢子虫侵染机制奠定了基础。 相似文献
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[目的]为开发研制功能性芹菜源农药提供理论依据和试验数据。[方法]以果蝇为试验对象,研究并比较芹菜原汁和不同浓度的芹菜乙醇提取液对果蝇的驱避、触杀、熏蒸作用。[结果]随着浓度的增加,芹菜提取液对果蝇的驱避作用增强,驱避效果达100%,而芹菜原汁对果蝇的驱避效果为80%。芹菜原汁及不同浓度的芹菜乙醇提取液对果蝇的触杀效果均为0。在芹菜原汁和乙醇提取液的熏蒸作用下,果蝇在短时间内死亡。[结论]芹菜的乙醇提取液对果蝇的驱避效果和熏蒸效率果均可达到100%,并且随着浓度的增加,驱避效果增强。 相似文献
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马传染性贫血病毒(EIAV)gp45基因编码跨膜蛋白TM,该蛋白在介导病毒与靶细胞之间的融膜过程中起关键作用。gpl20蛋白是人类免疫缺陷病毒(HIV)的外膜糖蛋白,是病毒的主要抗原。通过大肠杆菌原核表达系统和果蝇细胞真核表达系统分别表达gp45及gp120,并对其表达效果进行对比,结果表明: 在大肠杆菌表达系统中,gp45可成功表达,而gp120却不能表达。在真核表达系统中,gp120成功表达,而gp45却未能表达。通过对这两种系统表达情况效果的比较,发现gp45在原核系统中表达有利,而gp120在真核系统中表达有优势,表明这些基因的表达具有特异性,本研究指导我们根据特定的基因选用适当的表达系统,以便纯化所需的目的蛋白,同时也为深入研究HIV的包膜蛋白的生物学结构特性及推动相关疫苗的研究奠定基础。 相似文献
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非洲绿猴肾细胞外源绿色荧光蛋白基因表达的RNA干扰 总被引：3，自引：0，他引：3
非洲绿猴肾细胞(Vero)是多种病毒的适应细胞。本研究将外源的绿色荧光蛋白(GFP)基因转染到Veto-E6中,并利用体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA(siGFP)其表达进行干扰。结果显示：siGFP能有效阻断外源的绿色荧光蛋白基因在Vero-E6细胞中的表达,而不相关的siRNA则对绿荧光蛋白基因的表达没有影响。这为利用RNAi技术在Vero-E6细胞中,抑制外源基因的表达以及通过RNAi技术进行抗病毒的研究奠定了一定的基础。 相似文献