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根据GenBank上猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的已知序列,利用Primer Premier 5.0及DNAstar软件对上述病毒基因保守区进行引物设计,选出扩增序列为PRV gB基因373 bp、PCV2 ORF2基因430 bp两对引物。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了PRV-PCV2两重PCR检测方法。敏感性及特异性试验结果显示,该mPCR对2种病毒的核酸检测可至1.47×10-6~1.62×10-6 ng,而对灭菌双蒸水、猪细小病毒（PPV）猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）多重PCR的扩增结果均为阴性,作为临床上猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型感染的病原学快速诊断方法具有可行性。 相似文献
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根据猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪细小病毒（PPV）2种病原体的基因保守序列，分别设计并合成了与PRv的gp50基因序列和PPV的VP2基因互补的两对引物，进行单相PCR，分别扩增出预期的217bp片段及158bp片段；同时，用这两对引物对混合的样品中的PRV和PPV的DNA模板进行二联PCP扩增及二联PCR反应条件的优化，结果得到2争与试验设计相符的217bp（PRV）和158bp（PPV）特异性务带：敏感性检测结果表明，对PRv的检测可以达到10^6.11／20μL TCID50对PPV的检测可以达到0．008HA单位的核酸模板。本文建立的PCR方法，可以在24h内对样品进行快速检测，可作为PRV、PPV感染和临床样品检测的可靠手段。 相似文献
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根据GenBark中登录的猪圆环病毒2型基因序列,应用PrimerPremier5.0设计筛选一对扩增ORF2基因引物,建立从猪病料中直接检测PCV2感染的PCR方法。扩增PCV2阳性样品出现一条447bp的特异性DNA条带,扩增产物测序结果证实为PCV2ORF2基因序列。应用本方法扩增猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等常见猪病原均未出现特异性条带,表明方法特异;敏感性试验结果表明,样品DNA模板检测浓度可达到9.8×10-4ng/μL;重复性和稳定性试验结果表明,用本试验建立的PCR方法进行PCV2检测,结果稳定可靠。经病猪临床检测应用,在66份病猪样本中,PCV2感染阳性率为27.27%,且多与PRRSV、PRV、HCV、PPV等一种或多种病毒混合感染,混合感染比例达72.22%。 相似文献
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PRV、PCV2与PPV三重PCR检测方法的建立与初步应用 总被引：3，自引：0，他引：3
为建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)与猪细小病毒(PPV)的三重PCR方法,根据Gen Bank登录的病毒相关基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上3种病毒的PCR诊断方法,扩增的目的片段长度分别为192 bp(PRV)、255 bp(PCV2)和759 bp(PPV)。对PRV、PCV2和PPV的核酸检测最低浓度分别为:2.5×10-2,2.2×10-3和3.7×10-2ng,证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性。应用该方法对56份临床样品进行检测发现,PRV、PCV2和PPV的阳性率分别为16.1%、50.0%和19.6%,二重感染率为12.5%,三重感染阳性率为3.6%。该方法的成功建立为快速高效地检测以上3种病毒提供了有效手段。 相似文献
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《中国兽医学报》2020,(1):9-13
为了能够同时检测和鉴别猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。本研究参考GenBank中公布的PRV gE基因和PCV3基因组序列,且基于PRV gE和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0引物设计软件设计了2对特异性引物,随后对其扩增条件进行优化,建立了能够同时检测PRV和PCV3的双重PCR检测方法。该方法可以同时扩增PRV的429 bp和PCV3的344 bp特异性片段,而对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。PRV和PCV3的最低检测值分别为502.0和91.2 copies/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和灵敏性。本试验建立了能够同时快速检测PRV和PCV3,且具有高度特异性和灵敏性的双重PCR检测方法,为PRV和PCV3的检测提供技术支持。 相似文献
8.
在GenBank中收集猪细小病毒(PPV)结构蛋白VP2基因、猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2序列、猪伪狂犬病毒(PRV)的gB基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的NSP2基因、猪瘟病毒(CSFV)的E2基因和乙型脑炎病毒(JEV)的M基因,利用Primer5.0等分子生物学软件对收集的序列分析比较,筛选出上述基因的特异保守序列并设计引物和探针,将设计好的探针与相应的微球偶联,优化条件,建立检测方法。结果表明:建立的检测PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV6种病毒核酸的多重液相芯片技术具有较好的特异性、敏感性和稳定性,对PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV6种病毒核酸的最低检出量分别为8.50×10~2copies/μL、2.87×10~2copies/μL、2.07×10~2copies/μL、2.61×10~2copies/μL、2.34×10~2copies/μL、2.05×10~2copies/μL,与相应病毒PCR/RT-PCR检测方法相比,敏感性提高了100~1000倍;对临床388份样品同步进行荧光PCR与液相芯片检测,结果99.87%相符。本方法为液相芯片技术在动物多病毒快速高通量检测、鉴别诊断等应用方面奠定了基础。 相似文献
9.
本研究旨在建立多重Real-time PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV).根据GenBank数据库中PRRSV、PCV2、PRV、和PPV的核苷酸序列设计特异性引物和探针,通过优化反应条件,检测系列稀释的纯化阳性质粒,建立检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的单项和多重Real-time PCR方法.灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单项和多重Real-time PCR检测,该方法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对4种病毒的最低检测量为＜101拷贝或1 TCID50,检测灵敏度比常规PCR高100倍.对40份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果完全一致.建立的同时检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的多重Real-time PCR方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能对样品进行定量检测等优点. 相似文献
10.
《中国兽医杂志》2015,(10)
为了建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PRV gE基因和PCV-2 ORF2基因的核苷酸序列,分别设计了2对特异性引物PRV-S/PRV-A和PCV-2-S/PCV-2-A,产物分别为270 bp和189 bp。检测结果显示,该方法具有较高特异性,检测PRV和PCV-2的DNA最低量均为1×10~(-4)μg/μL。对136份临床上疑似为PRV和PCV-2感染病料样品进行检测的结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法可用于临床上PRV和PCV-2引起的单纯或混合感染的传染病病原学诊断。 相似文献
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根据GenBank中已发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型 (porcine circovirus type 2,PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV 的VP2、PRV的 gD、和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了3种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV 313 bp、 PRV 217 bp和PCV2 447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明两者的符合率为100％,表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用建立的多重PCR检测方法,检出PPV阳性42份,阳性率为19.91%;PRV阳性26份,阳性率为12.32%;PCV2阳性56份,阳性率为26.54%;2种以上病毒混合感染25份,混合感染阳性率为11.85%。检测结果表明,山西省猪群已感染这3种疫病。 相似文献
12.
PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV复合PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank上猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV）的已发表序列,分别设计并合成了5对特异性扩增引物,建立PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV单项PCR检测方法,分别扩增出预期的466bp、759bp、349bp、202bp和706bp片段。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了PCV2．PPV-PRV-PRRSV-CSFV复合PCR检测方法,为预防和控制上述几种病毒性传染病提供了一种快速、敏感、特异的检测方法。 相似文献
13.
多重PCR检测猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究 总被引：7，自引：0，他引：7
根据GenBank上已发表的猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）的VP2基因序列和猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）的gH基因序列，设计合成了两对特异引物，分别建立了PPV和PRV的单项PCR诊断方法，通过对扩增条件的筛选，最终成功地建立了PPV和PRV的复合PCR诊断方法，即利用一次PCR反应，可同时扩增PPV的751bp和PRV355bp的特异性片段，而扩增猪圆环病毒Ⅱ型（PCV．2）及相应的培养细胞（PK-15）核酸结果均为阴性，对PPV和PRV的最低检出量分别为100Pg和10Pg的DNA。该方法适合对PPV和PRV的联合检测和鉴别诊断。 相似文献
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多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒 总被引：26，自引：0，他引：26
根据猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)3种病原体的基因保守序列，分别设计了与CSFV的E2基因、PPV的VP2基因和PRV的gⅡ基因序列互补的3对引物。用这3对引物对人为混合的样品中的PPV和PRV的DNA模板及CSFV反转录后的cDNA模板进行多重PCR扩增和多重PCR反应奈件的优化，结果同时得到3务与试验设计相符的288bp(CSFV)、575bp(PPV)700bp(PRV)特异性条带；敏感性检测结果表明，该多重PCR可以检测到14．5ng／L的CSFV、27．1pg／L的PPV、31．4ng／L的PRV的核酸模板。 相似文献
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猪细小病毒2型、3型、6型多重PCR检测方法的建立及初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立同时快速检测猪细小病毒2型(PPV2)、猪细小病毒3型(PPV3)、猪细小病毒6型(PPV6)的方法,本研究根据PPV2、PPV3、PPV6各自的NS基因序列设计3对特异性引物,建立了一种能同时检测上述病原的多重PCR方法。结果显示,建立的多重PCR方法对PPV2、PPV3、PPV6的基因组DNA均能有效扩增,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、日本乙型脑炎病毒(JEV)的核酸均无特异性扩增,特异性较强;对PPV2、PPV3、PPV6的重组质粒最低检测限分别为4.32×10^3拷贝/μL、9.62×10^3拷贝/μL、4.25×10^3拷贝/μL,与其他研究者已建立的单一PCR检测结果一致,敏感性较高。利用本研究建立的多重PCR方法对25份可疑临床样品检测,同时利用文献报道的单一PCR方法检测,二者结果一致。本研究建立的多重PCR方法为检测PPV,及该病的流行病学调查提供了技术支持。 相似文献
16.
为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明：建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。 相似文献
17.
《中国兽医学报》2016,(3):378-383
参照GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因以及猪圆环病毒2型(PCV2)中ORF2特异性序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PRV野毒株和猪圆环病毒(PCV2)的双重荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测PRV和PCV2灵敏度分别可达2.23×101、4.5×102拷贝/μL,均比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料进行检测并与普通PCR进行比较,结果显示,二者检测PRV的总符合率为96.67%,检测PCV2的总符合率为93.33%。本试验建立的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法可同时对PRV野毒株和PCV2进行早期快速诊断,可应用于病原学监测,流行病学调查等。 相似文献
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多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究--猪瘟病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒多重PCR引物设计 总被引：8，自引：2，他引：6
在GeneBank中查出CSFV、PPV、PRV的所有已知序列。对病毒各基因区进行同源性分析 ,确定CSFV的E2 基因 ,PPV的VP2 基因和PRV的 gⅡ基因为各病毒扩增的靶序列。利用DNAsis对上述保守区进行引物设计 ,对设计出来的 3种病毒引物利用DNAstar进行引物二聚体分析 ,以避免引物之间形成稳定的引物二聚体。选出扩增序列为CSFV 2 88bp、PPV575bp和PRV 70 0bp的 3对引物 ,并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行分析。避免它们之间有较高的同源性或互补性 ,从而确定了 3种病毒的多重PCR引物 相似文献
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根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。 相似文献
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根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)有关基因序列,通过序列比对及参考相关文献,设计了3对特异性引物。通过优化,建立了可同时检测PCV2、PRV及PPV 3种病毒的多重PCR方法。结果表明,该方法能同时检测到PCV2、PRV及PPV的最低核酸量分别为40pg、72pg、46pg。对猪圆环病毒3型(PCV3)、猪细环病毒(TTSuV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)无扩增。应用该方法对87份临床样品进行检测,PCV2阳性检出率为28.7%(25/87),PRV野毒检出率为11.5%(10/87),PPV检出率为12.6%(11/87)。其中2种以上病毒混合感染阳性率为13.8%(12/87),3种病毒同时感染的阳性率为2.3%(2/87),其结果也与单一PCR结果一致。研究结果提示,该方法可用于PCV2、PRV、PPV三种病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。 相似文献