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《江苏农业科学》2018,(21)
在利用里氏木霉降解纤维素为葡萄糖继而发酵生产液体燃料和大宗化学品的工业生产过程中,降解纤维素为葡萄糖是关键的一步。β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的活性及其表达时起到至关重要的双重作用。为了研究β-葡萄糖苷酶Cel1a在里氏木霉Rut C-30中对纤维素酶诱导表达及其酶活性的影响,以里氏木霉的基因组DNA为模板,设计扩增看家基因(β-actin)的启动子(Pact)和cel1a的引物,分别进行Pact、cel1a的PCR扩增,然后利用重叠PCR将Pact、cel1a连成1个片段Pact-cel1a,再通过酶切成功地将Pact-cel1a片段连接到p CAMBIA1300二元质粒上,从而为后续研究β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活性及其表达过程中的作用奠定了基础。 相似文献
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【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小为76ku的目的蛋白条带,在SP-Q01细胞中重组酶活性最高达155U/mL,最佳培养时间为72h,产生酶活的最适温度为60℃。【结论】成功克隆出了绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,该基因能在粟酒裂殖酵母细胞中成功表达,为绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的深入研究和应用奠定了基础。 相似文献
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丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时,它们会形成较高的纤维素酶背景,而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因,以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中,cbh1的表达完全消失,而eg2基因的表达水平较出发菌株SUS5降低了98%。以该转化子为宿主表达外源基因NfBgl3A,两个代表性转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U·mL-1,远高于以出发菌株（高纤维素酶背景）为宿主表达β-葡萄糖苷酶酶活（两个代表转化子分别为11.6和31.9 U·mL-1）。因此,构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主,还可明显的提高某些异源基因的表达水平。 相似文献
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丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时，它们会形成较高的纤维素酶背景，而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISPR/Cas9技术，在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因，同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因，以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中，cbh1的表达完全消失，而eg2基因的表达水平较出发菌株SUS5降低了98%。以该转化子为宿主表达外源基因NfBgl3A，两个代表性转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U·mL-1，远高于以出发菌株（高纤维素酶背景）为宿主表达β-葡萄糖苷酶酶活（两个代表转化子分别为11.6和31.9 U·mL-1）。因此，构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主，还可明显的提高某些异源基因的表达水平。 相似文献
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目前饲料工业中所使用的纤维素酶和葡萄糖氧化酶来自不同的表达系统,其生产成本较高;而在同一种微生物宿主中同时表达这两种重要的饲料工业用酶则有可能会降低成本。根据里氏木霉中密码子的偏好性优化黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因god,并利用DNA assembler方法构建pRS424-cbh1P-god-cbh1T质粒(p PGT质粒);通过PEG介导的原生质体转化法,将其转入里氏木霉Tu-6Δtku70尿嘧啶缺陷型菌株中,经筛选得到葡萄糖氧化酶酶活较高的一株转化子(2号),SDS-PAGE分析显示重组GOD的蛋白分子量大小约为70 k Da,进一步使用质谱确证了GOD得到成功表达。摇瓶发酵表明,2号转化子在微晶纤维素诱导92 h后,GOD酶活达到4.63 U/m L。该转化子的滤纸酶活、内切葡聚糖酶活和外切纤维素酶活分别为7.88 U/m L、2.58U/m L和0.84 U/m L,而出发菌株分别为6.79 U/m L、3.19 U/m L和0.57 U/m L,而β-葡萄糖苷酶由原来的0.66U/m L提高到1.65 U/m L(1.5倍)。实验表明,在里氏木霉中表达GOD能显著提高β-葡萄糖苷酶的酶活,也能使总体纤维素酶活得到提高。 相似文献
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里氏木霉产纤维素酶碳源优化 总被引：1，自引：0，他引：1
分别使用不同预处理的纸浆、麸皮和玉米秸秆为碳源,诱导里氏木霉产纤维素酶。结果显示,使用φ(H2SO4)1.5%处理纸浆对里氏木霉产纤维素酶诱导效果最好,产酶历程中,最大的滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活分别为2.92 IU/mL、2.20 IU/mL和0.89 IU/mL。处理玉米秸秆有较好的产酶诱导作用,分别使用10 g/L、50 g/L NaOH处理或φ(H2SO4)=1.5%处理玉米秸秆,滤纸酶活最大分别达到2.37 IU/mL、2.33IU/mL和2.53 IU/mL。麸皮是较差的里氏木霉产纤维素酶诱导物,分别使用φ(H2SO4)=1.5%、10 g/LNaOH,10 g/L NaOH或苯醇处理的麸皮为碳源,滤纸酶活最大分别仅有2.16 IU/mL、1.76 IU/mL和1.84 IU/mL。 相似文献
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为了高效利用废弃的农作物秸秆,优化康氏木霉固态发酵秸秆生产β-葡萄糖苷酶的发酵参数,首先利用Plackett-Burman试验,对影响生产β-葡萄糖苷酶的参数麸皮添加量、(NH4)2SO4添加量、培养温度、培养时间、料水比、装料比、浸提液p H值进行了主要影响因子的筛选;然后再利用Center Composite Design响应面分析对产酶参数进行了优化。结果表明:培养温度和培养时间是影响固态发酵生产β-葡萄糖苷酶的主要因素;经CCD优化后,得到产酶最适条件为培养时间6.6 d、培养温度27℃,该条件下β-葡萄糖苷酶活性为77.68 IU/m L。验证试验证实,预测回归方程的预测值与试验值之间具有较高的拟合度。本研究结果可为农业秸秆资源的再利用和纤维素酶的工业化生产提供科学依据。 相似文献
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以康氏木霉RW-1为材料,采用固体发酵方法,对所产纤维素酶进行研究.结果表明,在初始pH值为6.0的条件下,最适培养温度为28℃,固体发酵最佳培养时间为108 h,最适接种量为8%,CMCase酶活、FPA酶活和β-葡萄糖苷酶活分别达14.2、9.2、4.8 U/g. 相似文献
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国内细菌纤维素酶基因的克隆进展 总被引：6，自引：0，他引：6
随着能源问题日益突出,各国逐渐把对纤维素的降解研究作为一项重要的研究课题。而纤维素的酶降解是利用纤维素的一个有效途径。目前主要对真菌纤维素酶的研究日趋成熟,且真菌纤维素酶的活性比较高,像里氏木霉、绿色木霉、康氏木霉等。对细菌纤维素酶基因克隆方面的研究也有很多报道,但普遍认为细菌纤维素酶活性比真菌纤维素酶的活性低。而细菌作为世界分布最广的生物具有非常大的开发价值空间。文章主要介绍目前对细菌纤维素酶基因的克隆领域的研究现状,并作了一个简要的概括和分析。 相似文献
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对影响里氏木霉(Trichoderma reesei )40359原生质体制备和再生的条件:包括茵龄、水解酶液的种类及浓度、酶解温度、酶解时间、再生培养基的稳渗剂进行了研究.结果表明:当茵龄为12 h,采用2%纤维素酶和2%蜗牛酶混合液,酶解温度30℃,酶解时间2h,用0.6 mol·L-1蔗糖作再生培养基的稳渗剂,原... 相似文献
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[目的]优化里氏木霉RutC-30产纤维素酶的液体发酵条件。[方法]以里氏木霉RutC-30为出发菌株,通过单因素试验研究培养基不同氮源(硫酸铵、尿素、蛋白胨)及浓度、不同碳源(纤维素、乳糖、甘油、葡萄糖)及浓度和不同的初始pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)对产酶的影响,在此基础上选取氮源、碳源和pH为影响因子采用正交试验探讨里氏木霉RutC-30产纤维素酶的优化条件。[结果]正交试验分析表明,各因素对产酶影响顺序依次为碳源>氮源>pH,里氏木霉RutC-30产纤维素酶的最佳条件是:以1%纤维素为碳源、以0.5%蛋白胨为氮源,初始pH值为4.0,在30℃产酶发酵培养5 d,纤维素酶活力高达7.303 U。[结论]里氏木霉RutC-30经优化培养后,产酶能力可得到大幅度提高,具有潜在的工业应用价值。 相似文献
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Selection of Trichoderma mutants with enhanced cellulase production and resistant to catabolite repression 
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下载免费PDF全文 Szakacs G Megyeri L Kovacs K Zacchi G 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》2004,30(4):433-433
Due to high cost and relatively low efficiency of cellulase enzymes used for the saccharification of pretreated lignocelluloses, the improvement of cellulase secreting microorganisms is of vital importance. Trichoderma reesei QM 6a, an excellent source of cellulase was selected in the late 1960's. at Natick Laboratories by its performance on pure cellulose (Solka Floc, Avicel) . QM 6a is the wild parent strain of best existing hypercellulolytic mutants such as Rut C30, VTT-D-80133, L… 相似文献
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[目的]探讨碳氮源对里氏木霉发酵产纤维素酶的影响,以及纤维素酶水解稻草的条件。[方法]通过添加不同的碳源和不同浓度的酵母粉,探讨里氏木霉合适的发酵条件;使用不同添加量的纤维素酶对稻草进行酶解;分别利用纤维素酶、纤维素酶和木聚糖酶混合酶对稻草进行酶解反应。[结果]利用乳糖和稻草的复合碳源和12 g/L的酵母粉进行水解时,纤维素酶活性较高。酶解适宜的酶用量为每克稻草底物200 U的滤纸酶。用纤维素酶及木聚糖酶混合酶酶解稻草96 h的酶解得率为65.4%。[结论]该研究可为里氏木霉纤维素酶生产和酶解稻草的应用提供一定的依据。 相似文献
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里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及序列分析 总被引：2，自引：2，他引：0
文章以里氏木霉 (Trichoderma reesei)的基因组 DNA为模板 ,根据 Gen Bank上检索的 β-葡萄糖苷酶基因DNA序列 ,设计特异性引物 ,用高保真酶 probest polymerase进行 PCR扩增 ,获得了 2 .5 0 kb的 DNA片段。将其克隆在 p U C18的 Sma I位点上。测序结果表明 ,所获得的 DNA序列与 Gen Bank上检索的 β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列同源性达 99.90 % ,氨基酸序列同源性达 10 0 %。 相似文献
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里氏木霉产纤维素酶条件的优化 总被引：3，自引：1，他引：2
研究采用里氏木霉菌株30911、40358和40359,设计了9个影响里氏木霉产纤维素酶活性因素,对里氏木霉的纤维素酶活性进行了液体摇瓶发酵试验。结果表明,培养基中微晶纤维素和小麦麸皮的最适添加量分别为:微晶纤维素20 g·L-1,小麦麸皮80 g.L-1,微晶纤维素与小麦麸皮最适配比为1:4;接种孢子悬液浓度1×107个·mL-1,培养温度28～30℃,pH 5.5,培养时间72 h,摇瓶转速180 r·min-1,250 mL三角瓶中装液量为50～75 mL。 相似文献