共查询到20条相似文献，搜索用时 78 毫秒
1.
河南省鸡致病性大肠杆菌耐药性质粒的研究 总被引：9，自引：0，他引：9
对河南省32个县市的93株鸡致病性大肠杆菌进行耐药性质粒的分析,并对其中12株100%耐庆大霉素(GM)的菌株进行耐药质粒的转化试验,成功获取了2个转化子。质粒检测结果表明:93株鸡致病性大肠杆菌可以分为49种质粒图谱类型,质粒电泳条带最多6条,最少1条,其中质粒图谱为1条条带的菌株占测试菌株的45.16%;同一地区、同一鸡场菌株的质粒图谱相同或相似,不同地区菌株的质粒图谱不同,但它们之间会有相同或相近的少量流行质粒存在。质粒转化结果表明:同一质粒可编码1个至数个抗药性基因,不同质粒可以携带相同或不同的抗性基因,证明了质粒可以传递多种耐药性,细菌的抗药性与抗药性质粒的转移有很大关系。 相似文献
2.
根据编码拟南芥成膜素相关蛋白(PhrIP1)基因cDNA全序列设计超表达引物,以1～1000bp之间序列设计GFP引物和序列内部第24～240bp之间序列设计RNAi引物,以pMD18-T-PhrIP1为模板,用PCR方法分别扩增出1.8kb、1.0kb和0.216kb的片段,分别克隆至双元表达载体、GFP载体和RNAi载体上,得到了植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1。用电转化法,将这些重组质粒导入农杆菌GV3101菌株中,PCR扩增结果表明所构建的植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP融合载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1已导入农杆菌。 相似文献
3.
OmpT(Outer-membrane proteases T)是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。利用大肠杆菌OmpT降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽,可以为开发抗OmpT蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。根据大肠杆菌外膜蛋白酶OmpT的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954 bp的序列,测序结果显示此序列与已公布序列同源性达99.99%。将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a上构建重组表达质粒pET28a-OmpT。经IPTG诱导后,在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36 kDa且具有生物活性的OmpT蛋白。生长曲线试验显示,抗菌肽LL37对带重组表达质粒pET28a-OmpT的大肠杆菌生长没有影响,而对照组的生长明显受到抗菌肽的抑制作用。 相似文献
4.
大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组中,仅dctA基因编码1个在有氧条件下负责摄取四碳-二羧酸的转运蛋白。为鉴定Dct A能否摄取四碳-2-羟基羧酸(如苹果酸),首先以p KD3为模版PCR扩增含有氯霉素抗性dctA基因同源臂,电转入E.coli K12/p KD46感受态细胞,筛选具有氯霉素抗性的基因敲除突变株E.coliΔdctA/p KD46。通过消除质粒p KD46构建大肠杆菌dctA基因敲除突变株E.coliΔdctA。构建dctA基因表达载体p Easy T3-dctA。通过苹果酸摄取功能互补试验,证实基因敲除菌株E.coliΔdctA丧失摄取苹果酸功能,四碳-二羧酸摄取蛋白Dct A具有摄取苹果酸功能。研究首次报道Dct A具有摄取苹果酸功能,该基因敲除突变株的构建可为其他菌株来源2-HCT转运蛋白的基因克隆与功能分析奠定基础。 相似文献
5.
目的:构建人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)原核表达载体,检测其在大肠杆菌Escherichia coli中的初步表达.方法:以含有人tPA基因的质粒为模板,设计引物扩增出含有RGDS-tPA基因并构建到原核表达载体pET28a中,测序证实为正确的rtPA序列,并将pET28a-tPA转化至菌株E.coli BL21(DE3).用IPTG诱导rtPA在E.coli中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证.结果:琼脂糖凝胶电泳获得目的基因片段tPA的条带约在1 700bp处,鉴定为阳性重组体;聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得目的蛋白片段rtPA的条带约53KDa,为非活性的包涵体.结论:人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体构建成功,可在大肠杆菌中有效表达. 相似文献
6.
为了将绿色荧光蛋白(GFP)引入大肠杆菌中表达并且进行蛋白的纯化,以提高GFP在大肠杆菌中的表达量,用于传统检测方法的改进及目的菌的应用研究.将人工重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),研究大肠杆菌菌株在温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对HIS-GFP融合蛋白表达量的影响.结果:大肠杆菌菌株BL21(DE3)在37℃培养下,D600为0.6～0.8,使用终浓度为0.5 mmol/L的IPTG在15℃诱导培养12 h时,HIS-GFP融合蛋白表达量最高,表达的HIS-GFP融合蛋白可占细菌总蛋白的40％以上.用Ni-IDA亲和层析柱对HIS-GFP融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析表明HIS-GFP融合蛋白大小约为68 ku,与预计的分子量大小一致,Western blotting分析表明其能与Anti-HIS单克隆抗体起特异性反应. 相似文献
7.
以致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌分离株G8107菌株基因组DNA为模板,用PCR法扩增ompA precursor基因,PCR产物用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,酶切产物回收与相同黏性末端的表达载体pET-32a(+)连接构建表达ompA precursor的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主菌BL21(DE3),抽提质粒,酶切鉴定及测序正确后诱导表达。对转化菌株以IPTG进行诱导后,裂解细菌,离心,上清进行SDS-PAGE鉴定。测序结果显示,ompA precursor基因大小为1 014 bp,编码338个氨基酸残基,蛋白相对分子质量约为36。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以28℃1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h,该基因表达效果最好。经Western Blot检测,表达的重组蛋白可与抗His标签蛋白单抗反应。 相似文献
8.
禽大肠杆菌O2、O78菌株外膜蛋白A基因扩增及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据Genbank中大肠杆菌K-12外膜蛋白A基因的核苷酸序列设计引物,从禽大肠杆菌O为O2、O78及它们的融合株O2．78(Chl^rNor^r)中分别扩增得到外膜蛋白A基因(ompA),进行序列测定及分析发现3个菌株的ompA均由2276nt组成,核苷酸序列完全相同,只有一个大的开放性阅读框(ORF),长1041bp,编码由346个氨基酸组成的前外膜蛋白A(pro-OmpA),前21个氨基酸残基组成信号肽,成熟的OmpA由325个氨基酸残基组成,相对分子质量为37000．其氨基酸序列也完全相同．从基因水平上证明了禽大肠杆菌O2和O78菌株存在相同的外膜蛋白A抗原。 相似文献
9.
《吉林农业大学学报》2014,(1)
根据GenBank上查到的人胶原蛋白序列COL6A2(NM058175.2),利用Primer 5设计特异性引物,以吉林农业大学生物物理实验室构建的重组质粒pCMV-Sport6-COL6A2为模板进行目的基因的克隆,获得目的基因COL6A2,然后用双酶切的方法连接目的基因COL6A2和表达载体pET32a,将连接产物转化到大肠杆菌中构建原核表达载体pET32a-COL6A2。再将鉴定成功的重组质粒pET32a-COL6A2分别转化到大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、BL21(BE3)plysS及Rosetta(DE3)中,采用1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,经12%SDS-PAGE电泳分析并筛选出重组蛋白表达量最高的菌株。利用Ni Sepharose 6 FastFlow琼脂糖树脂亲和层析柱纯化重组蛋白。结果表明:获得了大小为570 bp的COL6A2片段,经测序鉴定序列正确;成功构建了pET32a-COL6A2原核表达载体并表达出约30 kD的目的蛋白;筛选出BL21(DE3)作为高效表达菌株,其重组蛋白表达量占菌体总蛋白的23.9%;经镍离子亲和层析纯化获得了纯度90%的目的蛋白。 相似文献
10.
【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。 相似文献
11.
鸡大肠杆菌1型菌毛是一种重要的致病因子,可以黏附到家禽机体的呼吸道上皮,从而引起机体发病。1型菌毛基因簇由fimB,fimE,fimA,fimI,fimC,fimD,fimF,fimG和fimH等组成。在国外K12株大肠杆菌1型菌毛fimE基因是一个大小为为555 bp,具有相变开关功能的片段,我国鸡源大肠杆菌1型菌毛fimE基因序列尚未见报道。本研究通过聚合酶链式反应扩增、克隆到了鸡大肠杆菌MG10株1型菌毛的fimE基因,测定了基因序列,并运用相关软件将其翻译成氨基酸序列。通过对fimE基因序列分析比较及对fimE蛋白进行预测分析,发现鸡大肠杆菌与K12大肠杆菌1型菌毛的fimE基因之间的同源性达到99.1%以上;亲水性、抗原性预测表明,二者之间都存在密切的相似相关性。结果表明,核酸同源性为99.5%。fimE基因的核苷酸序列中有5个核苷酸残基发生了改变,而预测氨基酸序列变化仅第184位氨基酸由缬氨酸V变为丙氨酸A;其余无核苷酸的变化。 相似文献
12.
《东北农业大学学报》2020,(6)
以产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)K88为宿主菌,从养殖场污水中分离出一株短尾裂解性噬菌体vB_EcoP_E21。该噬菌体可侵染多株大肠杆菌,一般生物学特性分析表明最佳感染复数为0.1,潜伏期和爆发期均为20 min,裂解量为370 PFU·cell-1;对氯仿不敏感,可在40～60℃,pH 4.0～10.0条件下保持较高活性;全基因组测序结果表明其基因组长度为58 536 bp,(G+C)%含量为46.89%,含66个开放阅读框,其中23个为已知编码序列;不含tRNA、溶源基因、毒力因子和抗生素耐药基因;噬菌体终末端酶大亚基和主要衣壳蛋白系统发育树同源性分析结果显示,该大肠杆菌噬菌体与变形杆菌(Proteus)噬菌体P16-2532、PM87、pPM 01和Saba亲缘关系较近,但无法侵染变形杆菌属(Proteus spp.)标准菌株。 相似文献
13.
根据GenBankTM中发表的牛IL-15基因序列设计并合成了特异性引物,以经LPS和ConA刺激的牛外周血单个核细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度约500 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切、PCR及序列测定结果表明,获得了牛IL-15全长基因的克隆.进一步通过PCR方法得到缺失其N端48个氨基酸的信号肽序列的牛IL-15成熟蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组表达质粒pET-IL-15,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,该菌表达以包涵体形式存在的相对分子质量约为33 000的融合蛋白.用Ni螯合层析方法纯化表达的蛋白.Western-blot试验显示表达的重组融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应,同时也能与鼠抗猪IL-15的多克隆抗体发生明显交叉反应. 相似文献
14.
纤维素酶的工业应用一直受成本高、酶活低的限制,而内切葡聚糖酶作为纤维素酶最主要的组成部分,提高内切葡聚糖酶的酶活力显得尤为重要。根据GenBank中收录的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KCTC的模式菌株和解淀粉芽孢杆菌HZ79内切葡聚糖酶序列的相似性及orf分析设计特异性引物,以解淀粉芽孢杆菌的基因组DNA为模板,利用PCR反应克隆出长为1 500 bp的内切葡聚糖酶基因(egl基因),将目的基因与pMD19-T载体相连,转入大肠杆菌DH5α,阳性克隆经菌液PCR及双酶切验证,将验证正确的质粒送金唯智测序公司测序。比对结果表明:该克隆片段无碱基缺失,无移码突变,扩增序列准确、可靠。将测序正确的重组质粒转化BL21,进行大肠杆菌BL21(DE3)的原核表达,SDS-PAGE分析蛋白的大小为55 ku,等电点为8.12。为后续的内切葡聚糖酶基因突变体文库的建立,及egl酶酶活力及耐受性提高菌株的高通量筛选奠定前期基础。 相似文献
15.
通过分子克隆手段获得大肠杆菌来源的羧酸酯酶BioH,采用定向进化的方法提高该酶的水解活性以提升其应用价值.通过PCR扩增,从大肠杆菌K12菌株中克隆得到羧酸酯酶BioH基因,目的基因长度为771bp,含256个氨基酸;将其连接到pET30a(+)质粒上并转入BL21(DE3)宿主细胞中,经诱导表达得到所需的目的蛋白,该蛋白分子质量约为28.2ku.野生型的BioH水解对硝基苯丁酸酯(p-NPB)的活性为18U/mg,且该酶具有良好的热稳定性.以p-NPB为底物进行高通量筛选,其水解底物为对硝基苯酚(p-NP),在405nm处有最大吸收峰.挑选出水解活性提高的突变体,并通过2轮定向进化过程,成功筛选到7个水解活性提高的优良突变体,它们的活性分别提高了20%~100%.结构分析表明,突变体的突变位点均分布在远离活性中心的位置. 相似文献
16.
异戊烯基焦磷酸合酶（isoprenyl diphosphate synthase, IDS）在植物萜类多样化产物合成中发挥重要作用。克隆了薰衣草LaGGPPS5基因，其开放阅读框为1 038 bp，编码345个氨基酸，蛋白的相对分子量为37.20 kD，在薰衣草的茎和叶中表达量显著高于其他组织，在花蕾和花中表达量极低。利用包含MVA途径上游基因的载体共转化构建重组大肠杆菌菌株，经IPTG诱导后，重组蛋白LaGGPPS5表达条带37 kD左右，与预测蛋白分子量一致。GC-MS检测发酵产物显示，在MVA途径基础上，重组LaGGPPS5的BL21 (DE3)菌株合成了包括香叶醇乙酯、反，反-金合欢乙酯、香茅醇乙酯、橙花醇乙酯、2,3-二氢金合欢醇乙酯、反式-金合欢醇、香叶醇等25种单萜和倍半萜及其衍生物，萜类组分占挥发性物质总量的88.2%，其中香叶醇乙酯和反，反-金合欢乙酯的相对含量各占总含量的43.21%和20.36%，单萜类和倍半萜类挥发性物质分别占萜类总量的65.38%和34.62%，表明LaGGPPS5兼具香叶基焦磷酸合成酶（GPPS）和法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）的功能。研究结... 相似文献
17.
【目的】以大肠杆菌ATCC43889为试材,研究热胁迫处理对其细胞膜和膜蛋白的影响,为高温杀菌技术在食品工业中的应用奠定理论基础。【方法】研究ATCC43889分别经50℃、60℃和70℃热胁迫处理15 min并转接10次培养后,获得的3种抗热性ATCC43889菌株的细胞膜和膜蛋白变化。采用扫描电子显微镜分别观察原始对照菌株和3种抗热性菌株个体形态的变化;采用96孔微量酶标板法测定各菌株生物被膜生成能力的强弱;用气相色谱法测定各菌株细胞膜脂肪酸组成的变化及其差异;用差示扫描量热法测定各菌株细胞膜磷脂相变温度的变化;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法检测各菌株外膜蛋白表达的变化。【结果】大肠杆菌ATCC43889分别经50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养后,其个体形态变化明显,经50℃热胁迫后,部分菌株由球状体变为长杆状;经60℃热胁迫后的菌株个体形态较50℃热胁迫处理的菌株细长;经70℃热胁迫处理后大部分菌株变成了更细长的杆状,大量的菌株聚集在一起,菌体表面呈凸凹不平的无规则形态。随着热胁迫温度的提高,ATCC43889抗热性菌株的生物被膜生成活力增大,其生物被膜生成能力增强,3种抗热性菌株的生物被膜生成能力与对照组相比差异显著（P<0.05）,60℃和70℃下获得的2种抗热性菌株的生物被膜生成能力差异不显著（P>0.05）。与对照的原始菌株相比,经过50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养的菌株,缺失了3种脂肪酸,分别为C18:1n9c、C18:3n3和C21:0,随着热胁迫温度的提高,热胁迫菌株细胞膜中C13:0、C16:0和C17:0等饱和脂肪酸（SFA）及其总含量升高,而C14:1、C16:1、C17:1、C18:1n9t和C18:2n6t等不饱和脂肪酸（USFA）及其总含量降低,总SFA/总USFA比值增大,SFA/USFA比值越大,菌体细胞膜流动性越弱。随着热胁迫温度的提高,ATCC43889抗热性菌株细胞膜磷脂的熔点（Tm）升高,表明细胞膜磷脂的相变温度升高,细胞膜流动性降低,热胁迫温度越高,细胞膜流动性越低;随着热胁迫温度的提高,分子质量在63 kD和75 kD附近的条带颜色逐渐变深,分别经60℃和70℃各10次热胁迫并转接10次培养获得的2种抗热性菌株,其细胞外膜蛋白分子质量在48—75 kD均增加了特异条带;胁迫温度越高,一些外膜蛋白表达量及其种类增加,ATCC43889的耐热性越强。【结论】随着热胁迫温度的升高,ATCC43889个体形态变长,生物被膜生成能力增强,饱和脂肪酸含量升高,不饱和脂肪酸含量下降,细胞膜磷脂的相变温度升高,细胞膜流动性降低,一些外膜蛋白表达量提高、表达种类增加,菌株耐热性增强,这些变化有利于其适应不利的热胁迫环境,提高生存能力。 相似文献
18.
《中国农业科学》2020,(5)
【目的】以大肠杆菌ATCC43889为试材,研究热胁迫处理对其细胞膜和膜蛋白的影响,为高温杀菌技术在食品工业中的应用奠定理论基础。【方法】研究ATCC43889分别经50℃、60℃和70℃热胁迫处理15 min并转接10次培养后,获得的3种抗热性ATCC43889菌株的细胞膜和膜蛋白变化。采用扫描电子显微镜分别观察原始对照菌株和3种抗热性菌株个体形态的变化;采用96孔微量酶标板法测定各菌株生物被膜生成能力的强弱;用气相色谱法测定各菌株细胞膜脂肪酸组成的变化及其差异;用差示扫描量热法测定各菌株细胞膜磷脂相变温度的变化;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测各菌株外膜蛋白表达的变化。【结果】大肠杆菌ATCC43889分别经50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养后,其个体形态变化明显,经50℃热胁迫后,部分菌株由球状体变为长杆状;经60℃热胁迫后的菌株个体形态较50℃热胁迫处理的菌株细长;经70℃热胁迫处理后大部分菌株变成了更细长的杆状,大量的菌株聚集在一起,菌体表面呈凸凹不平的无规则形态。随着热胁迫温度的提高,ATCC43889抗热性菌株的生物被膜生成活力增大,其生物被膜生成能力增强,3种抗热性菌株的生物被膜生成能力与对照组相比差异显著(P0.05),60℃和70℃下获得的2种抗热性菌株的生物被膜生成能力差异不显著(P0.05)。与对照的原始菌株相比,经过50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养的菌株,缺失了3种脂肪酸,分别为C18:1n9c、C18:3n3和C21:0,随着热胁迫温度的提高,热胁迫菌株细胞膜中C13:0、C16:0和C17:0等饱和脂肪酸(SFA)及其总含量升高,而C14:1、C16:1、C17:1、C18:1n9t和C18:2n6t等不饱和脂肪酸(USFA)及其总含量降低,总SFA/总USFA比值增大,SFA/USFA比值越大,菌体细胞膜流动性越弱。随着热胁迫温度的提高,ATCC43889抗热性菌株细胞膜磷脂的熔点(Tm)升高,表明细胞膜磷脂的相变温度升高,细胞膜流动性降低,热胁迫温度越高,细胞膜流动性越低;随着热胁迫温度的提高,分子质量在63 kD和75 kD附近的条带颜色逐渐变深,分别经60℃和70℃各10次热胁迫并转接10次培养获得的2种抗热性菌株,其细胞外膜蛋白分子质量在48—75 kD均增加了特异条带;胁迫温度越高,一些外膜蛋白表达量及其种类增加,ATCC43889的耐热性越强。【结论】随着热胁迫温度的升高,ATCC43889个体形态变长,生物被膜生成能力增强,饱和脂肪酸含量升高,不饱和脂肪酸含量下降,细胞膜磷脂的相变温度升高,细胞膜流动性降低,一些外膜蛋白表达量提高、表达种类增加,菌株耐热性增强,这些变化有利于其适应不利的热胁迫环境,提高生存能力。 相似文献
19.
利用生物信息学软件I-Mutant2.0分析植物乳酸菌素PlnJ的氨基酸序列,筛选出最不稳定的氨基酸位点,进行定点突变,构建点突变重组表达质粒。对点突变重组表达质粒进行原核表达,并筛选表达最适条件;采用镍亲和层析法纯化重组蛋白。以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌,探究100℃水浴加热0、5、15、30 min对重组PlnJ抑菌功能的影响。结果表明,PlnJ第3位氨基酸——赖氨酸(AAG)对其稳定性具有重大影响。以人工合成第5位氨基酸,即赖氨酸(AAG)突变为缬氨酸(GTG)的PlnJ核苷酸序列作为模板,成功构建重组表达质粒,PCR和酶切鉴定结果显示目的条带184 bp,测序后证明突变成功。重组蛋白诱导表达条件的优化结果表明：在37℃、12 h、0.8 mmol·L-1IPTG的最优诱导条件下,特异目的蛋白表达显著(27.5 ku);咪唑洗脱液浓度280 mmol·L-1是最优洗脱条件,可获得较为单一的目的蛋白。采用牛津杯抑菌试验法及麦氏比浊法比较突变前后的PlnJ蛋白的抑菌效果,结果表明,突变后的蛋白[PlnJ(G5)]与突变前的... 相似文献
20.
【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因（ALUSP）,获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进行诱导表达,再通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得ALUSP功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量56.63 kD,理论等电点8.42;序列特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征,由A/B域（249 bp）、C域（198 bp）、D域（69 bp）和E域（489 bp）组成,其中C域高度保守,包含2个锌脂结构并含有1个P-盒和1个D-盒,且含有由8个氨基酸构成的核定位信号,D域含有1个识别DNA元件的T-盒,E域含有1个由8个α螺旋和1个β折叠形成袋状结构;氨基酸比对结果表明,ALUSP的氨基酸序列与稻绿蝽USP序列一致性最高（57.82%）,与其他昆虫的USP序列一致性较低,如膜翅目的Melipona scutellaris（46.05%）、Scaptotrigona depilis（45.94%）;系统进化树分析结果显示,半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP较为分化,位于不同分支,ALUSP与稻绿蝽USP进化关系最近,可能来源于共同的祖先。EcoR I和Xho I双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pEGX-6P-1载体上,命名为pEGX6P1-ALUSP;经37℃、1.0 mmol•L-1的IPTG诱导的pEGX6P1-ALUSP重组质粒可特异性表达1个约65 kD的蛋白,并且该重组ALUSP蛋白主要以包涵体形式存在;收集含有目的基因的菌株进行GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析,最后进行复性和纯化后在65 kD附近仅出现1条清晰的特异性条带,表明已得到纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP全长,其具有昆虫超气门蛋白的典型特征,并获得了原核表达的重组蛋白。 相似文献