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1.
应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。 相似文献
2.
以连接在pMD-18T载体上的香蕉条斑病毒云南分离物(BSV)全基因组为模板,设计特异引物,PCR扩增获得ORFⅠ全长序列。目的片段及原核表达载体pET32(b)分别经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接构建重组质粒pET32-ORFⅠ,将鉴定为正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,获得原核表达OFRⅠ工程菌。工程菌在28℃条件下,用浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达6 h,离心收集菌液并超声波破碎,获得以含目的肽段的可溶性蛋白为主的融合蛋白。将融合蛋白通过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后,得到纯度较高的融合蛋白。以此蛋白为抗原免疫家兔,获得特异抗血清,该抗血清的效价达1∶100 000,Western Blot验证表明,抗血清的特异性较强。本研究为BSV的快速检测以及BSV编码蛋白的功能研究奠定了基础。 相似文献
3.
香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是危害香蕉的主要病毒之一,严重威胁着香蕉的生产.BBTV基因组至少由6个环状ssDNA组分组成,其中DNA2组分变异最大,是否编码蛋白及其功能缺乏研究.本研究通过PCR方法克隆了BBTV Haikou2 DNA2ORF,将其构建到pET32a载体中,进行原核表达和抗血清制备.结果表明重组表达载体pET32a-DNA2ORF在表达菌Transetta(DE3)中表达一个约21 ku的特异融合蛋白,通过超声波破碎仪破碎细胞和诱导条件优化,分析表明,该蛋白主要以可溶形式存在,最佳表达条件为30℃、1.0 mmol/L IPTG诱导3h.融合蛋白经过Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化,免疫家兔制备出抗血清.Western blot实验表明抗血清具有特异性; 酶联法(ID-ELISA)测定表明,抗血清效价达到25 000,能够检测出香蕉汁液中加入的0.954 μg/mL浓度的表达纯化蛋白. 相似文献
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《中国糖料》2014,(2)
根据已发表ScYLV-P0基因系列设计特异性引物,应用RT-PCR技术从甘蔗病叶的mRNA扩增得到目的 DNA片段。以pET32a(+)为原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-P0。经过双酶切鉴定和DNA测序后,将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)pLySs,在30℃培养条件下IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况。表达结果显示,在该表达系统中,融合表达蛋白P0是以包涵体形式的蛋白存在;P0融合蛋白大小约45kDa,与P0开放阅读框的理论推算值29.991 kDa加上载体自身蛋白约18 kDa相符,用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清,通过酶联法(ID-ELISA)测定本实验制备的ScYLY-P0抗血清工作浓度为1∶25000。 相似文献
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6.
通过PCR方法从pCAMBIA1305载体上克隆了新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ的全编码序列,并插入到原核表达载体pET30a（+）中,构建了重组质粒pET30a nptⅡ。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌,经IPTG诱导,获得了相对分子量为35 kD的表达蛋白,约占全菌总蛋白的45％。表达蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。用5 mmol/L 二硫苏糖醇和1％十二烷基肌氨酸钠变性溶解包涵体,经透析后复性获得了可溶性重组蛋白。将可溶的表达蛋白用Ni2+ NTA亲和层析纯化,获得纯化的NPTⅡ蛋白,电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度达95％以上。体外活性检测显示,NPTⅡ蛋白具有良好的生物活性,在浓度30 μg/mL以上时可使卡拉霉素失去抑菌活性。 相似文献
7.
利用PCR方法分别扩增番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus,PRSV）、番木瓜畸形花叶病毒（papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）和番木瓜花叶病（papaya mosaic virus,PaMV）的外壳蛋白（coat protein,CP）基因,并连接到原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET28-PRSV-CP、pET28-PLDMV-CP和pET28-PaMV-CP,通过转化、诱导表达后,经SDS-PAGE分析显示,这3种CP蛋白在大肠杆菌中高效表达,其中PRSV CP蛋白和PLDMV CP以包涵体形式存在,PaMV CP以可溶蛋白形式存在。利用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化获得了3种病毒的重组CP蛋白,并免疫大白兔获得高效价的抗体。Western blot检测结果表明,这3种抗血清与对应的诱导表达蛋白发生特异反应。再采用抗血清建立一种快捷、简便和低成本的ID-ELISA（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay）技术,并利用此技术对海南岛283个疑似感病的番木瓜样品进行检测鉴别,初步掌握了海南岛3种主要番木瓜病毒的分布及感病情况,为下一步该病的有效防治策略提供科学依据。 相似文献
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根据文献并结合生物信息学方法选取大豆主要过敏原Gly m Bd 30k的抗原表位区,采用PCR方法扩增出该抗原表位区基因片段,并通过酶切连接分别构建单体的pET表达载体(pET-sGly)和二聚体的pET表达载体(pET-dGly),重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析;同时用Ni2+离子亲和层析柱纯化表达的sGly和dGly抗原表位蛋白,用western-blotting和ELISA检测重组蛋白的免疫原性。结果表明:表达的单体sGly蛋白以可溶性表达为主,而其二聚体dGly蛋白以包涵体形式存在,纯化的sGly和dGly蛋白都具有较好的免疫原性,重组蛋白sGly的抗原性更佳。成功构建的大豆主要过敏原Gly m Bd 30k蛋白的抗原表位区单体sGly蛋白及其二聚体dGly蛋白的工程菌,为研制大豆主要过敏原的单克隆抗体以制备用于大豆主要过敏原检测的试剂奠定了基础。 相似文献
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根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因(Ac Pmp)序列设计1对特异引物mp-FP/mp-RP,以病样槟榔总DNA为模板扩增该Ac Pmp的编码区并连接到p MD19T simple中间载体。将测序正确的阳性菌提取质粒p MD19T-Ac Pmp,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后回收Ac Pmp片段,然后以正确的编码框连接到原核表达载体p ET32a(+),转化Escherichia coli BL21感受态细胞。含有p ET32a-Ac Pmp的BL21表达菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,在30℃,0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4 h,可产生部分可溶性的融合蛋白。利用Ni2+-NTA亲和层析柱法进行纯化并获得高纯度的可溶性融合蛋白。将纯化后的融合蛋白多次免疫家兔,取其抗血清,以融合蛋白(1∶10 000稀释)作抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。Western Blot杂交结果表明槟榔植原体膜蛋白抗血清能与融合蛋白特异性结合。 相似文献
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用pET－21d构建齿兰环斑病毒（ORSV）外壳蛋白基因大肠杆菌表达载体pEO。经SDS－PAGE和Westernblotting分析，含pEO的大肠杆菌正确表达了ORSV外壳蛋白基因。此表达产物为融合蛋白。用表达产物制备抗血清，并应用于间接酶联法检测ORSV，具有较高的灵敏度（10ng／mLORSV）和特异性。 相似文献
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叶绿体蛋白12(chloroplast protein 12,CP12)是一个存在于叶绿体与光合作用相关的蛋白。以亲本柱花草热研2号叶片为材料,根据豌豆CP12及柱花草响应低温的cDNASSH文库中CP12克隆片段设计引物,采用RT-PCR,从柱花草cDNA中克隆获得柱花草热研2号CP12基因全长序列,并在GenBank登陆(登录号:HQ906668),命名为SgCP12。柱花草热研2号CP12基因全长426bp,包含399 bp的ORF。通过生物信息学分析结果表明,CP12的C端具有高度保守的结构域。同源性分析表明,该基因与豌豆的CP12基因氨基酸序列同源性最高。 相似文献
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大豆花叶病毒CP基因密码子使用偏性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)外壳蛋白(coat protein,CP)是SMV基因组的结构蛋白,在SMV侵染大豆的过程中发挥着重要的作用。运用CUSP和Codon W等软件分析了大豆花叶病毒外壳蛋白的密码子的偏性,并与SMV基因组的密码子偏性进行了比较。结果表明,SMV CP偏好于以A/T结尾的密码子;与SMV基因组密码子偏性相比,发现只有8种氨基酸密码子偏性完全一致。ENC与GC3的相关性分析结果显示,CP的密码子使用偏好性受碱基组成等多种因素共同影响。聚类分析显示基于基因CDS序列的聚类结果与基于密码子偏性参数相对密码子使用度(RSCU)的聚类结果基本一致。通过分析CP密码子使用特性,为进一步研究其功能奠定基础。 相似文献
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转EPSPS基因大豆植株中蛋白的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
采用ELISA定量测定法研究了转EPSPs基因大豆不同生长时期不同器官中CP4 EPSPS蛋白含量的变化.结果表明:转EPSPS基因大豆不同器官在不同牛育期CP4 EPSPS蛋白含量表现出较大的差异,R8期籽粒中的CP4EPSPS蛋白含量在所有时期和所有组织中蛋门含世最高;上位叶和下位叶中CP4 EPSPS蛋白除V3～V5期和R8期外的表达趋势一致,茎上部和茎下部中CP4 EPSPS蛋白在不同时期表达动态趋势基本一致,根中CP4 EPSPS蛋白含量存V3～V5期下降,然后逐渐升高,R1～R8期有一个大幅度的下降过程.从V1期至R8期,随着植株的不断生长,各组织中CP4 EPSPS蛋白的含量有明显的变化. 相似文献
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为筛选与小麦黄花叶病毒外壳蛋白(wheat yellow mosaic virus coat protein,WYMV-CP)互作的小麦蛋白,构建了小麦茎叶酵母双杂交cDNA文库,并从中筛选获得了与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段。从小麦茎叶中提取小麦总RNA,分离mRNA后,利用GATE-WAY技术将反转录得到的小麦cDNA片段定向转移到目的载体,同源重组反应后成功构建小麦cDNA文库。经检测,小麦cDNA文库的滴度为5.86×106 CFU·mL-1,库容量为2.34×107 CFU,重组率为95.8%。根据NCBI上WYMV-CP开放阅读框信息,构建了诱饵载体pGBK-CP,通过酵母双杂交筛选获得了若干阳性克隆,共转化试验初步验证了WYMV-CP与PEPCK、PAL等蛋白的互作关系。本研究利用酵母双杂交技术成功获得与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段,为明确WYMV的致病机制提供了科学的依据。 相似文献
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酵母双杂交技术研究NS3蛋白及其与CP，SP，NSvc4之间的互作 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR扩增水稻条纹病毒基因NS3,构建酵母表达载体,将其分别连接酵母诱饵载体pGBKT7与酵母捕获载体pGADT7,得到重组子pGAD-NS3和pGBK-NS3。自身毒性的实验结果表明,NS3蛋白对酵母细胞无毒性,其自身也没有自激活活性,不存在自身互作。将这2个重组子分别与水稻条纹病毒外壳蛋白CP、病害特异性蛋白SP、运动蛋白NSvc4两两共转化到酵母感受态细胞AH109中,转化产物涂布营养缺陷型培养基二缺、三缺、四缺平板,后经X-a-Gal染色观察,结果表明,NS3与SP的转化产物能在三缺平板上生长并在相应培养基中变蓝色,说明NS3与SP蛋白存在互作,该结果有助于进一步研究NS3蛋白的功能及彼此的互作在水稻条纹病毒致病机理上的作用。 相似文献
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受体细胞倍性对PVY CP基因向马铃薯遗传转化影响的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
利用整合PVYCP基因的改建质粒PEY3,以农杆菌为载体向四倍体栽培“甘农薯 1号” (2n =4x =4 8)及双单倍体“84 4 7” (2n =2x =2 4 )叶盘、叶柄、茎段导入PVYCP基因并获得再生植株。愈伤组织卡那霉素 (KM )抗性筛选试验表明 ,低倍体受体细胞利于外源基因的整合与表达 ,双单倍体转化率 (2 5 4 % )高于四倍体 (15 8% )。冠瘿碱分析证明再生植株整合了PVYCP基因。染色体倍性鉴定证明转基因再生植株与亲本倍性一致。 相似文献
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鉴定了致病性差异明显的6个大豆花叶病毒分离物，对这些分离物外壳蛋白（CP）基因进行了测序。6个分离物CP基因全长均为795bp，推测的CP全长均为265个氨基酸残基。序列同源性比较表明，症状反应相同的各SMV分离物间，CP基因核苷酸和推测的氨基酸序列同源性分别为98.2%～99.6%、99.6%～100.0%；而症状反应不同的分离物间，CP基因核苷酸和推测的氨基酸序列同源性分别为90.4%～96.7%和97.7%～99.6%。结果显示，致病范围相近的分离物，序列同源性较高。 相似文献
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PVYCP基因导入加工型马铃薯甘农薯1号的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
利用整合有马铃薯Y病毒外壳蛋白基 (PVYCP基因 )的改建质粒PEY3,以土壤农杆菌为载体转化加工型马铃薯新品种甘农薯 1号叶盘 ,细菌侵染 14d后用 10 0ml/LKM在愈伤组织水平上选择 ,转化率最高可达 2 1 3%。转化效率与细菌生理状态、NAA浓度、叶盘预培养天数有关。转化体分化 2株再生植株。冠瘿碱分析证明转化体整合了PVYCP基因。 相似文献