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实验在大肠杆菌产生的志贺样毒素2型变异体(Shiga-like toxin Ⅱ e,Stx2e)研究的基础上,设计了一对特异性引物,通过优化,建立了以PCR为基础,高效快速检测猪水肿病的PCR试剂盒.该试剂盒扩增的阳性条带为172 bp的特异性DNA片段,最低检出菌体量为120 CFU,在-20℃至少可保存12个月,重复性良好.应用猪水肿病PCR快速检测试剂盒对22份新鲜样本进行了检测,结果显示,其中的5个样本含Stx2e阳性大肠杆菌,PCR检测结果与剖检、细菌学和生化检验结果相一致. 相似文献
3.
对伪狂犬病病毒(PRV)国标PCR方法进行优化,建立一种高灵敏度的套式PCR方法。根据伪狂犬病病毒gD基因序列,设计并合成了2对引物,通过反应体系和条件的优化建立套式PCR方法。通过灵敏性试验、特异性试验、病料检测对比试验等验证建立方法的适用性。结果表明,建立的方法检测伪狂犬病病毒DNA的极限为2.6×10-7 ng/mL,灵敏度比国家标准方法提高了1 000倍,从疑似PRV感染组织病料中能大幅度提高阳性检出率。本研究成功建立了一种灵敏度高、特异性好的快速检测猪伪狂犬病病毒的套式PCR检测方法。 相似文献
4.
为了调查内蒙古部分地区规模化牛场奶牛隐孢子虫的感染情况及其虫种类型,试验在4个牛场采集了295份奶牛的粪样,从粪便样品中直接提取DNA进行套式PCR法检测,之后将其目的片段克隆至p GM-T载体上进行测序和同源性分析以鉴定虫种。结果表明:可通过套式PCR法从阳性粪便的DNA抽提物中扩增出目的条带,大小分别为800 bp和505 bp;对测得的序列和NCBI上已发表的安氏隐孢子虫(C.andersoni)18S rRNA基因序列进行BLAST比对分析,相似度为100%;采集样品的阳性率为14.9%(44/295)。说明套式PCR法可用于检测奶牛粪便样品中的隐孢子虫,且在一定程度上能够很好地反映出奶牛隐孢子虫的感染情况,并能有效鉴别其虫种。 相似文献
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为了建立特异、敏感、快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqManMGB探针实时荧光定量PCR方法,针对支原体ompA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立鹦鹉热嗜衣原体TaqManMGB探针实时荧光定量PCR检测方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。并对来自宁夏地区三个规模化奶牛养殖场的376份流产奶牛样品利用鹦鹉热嗜衣原体IHA诊断试剂盒和TaqManMGB探针实时荧光定量PCR进行检测。结果表明：建立的TaqManMGB探针实时荧光定量PCR方法敏感性为10培的总DNA,是一种可靠、快速、灵敏的检测鹦鹉热嗜衣原体的方法,并且成功应用于奶牛鹦鹉热嗜衣原体样本的检测。 相似文献
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单管套式PCR检测外源性禽白血病病毒 总被引：1，自引：1，他引：0
从贵州省4个养鸡场采集出现肿瘤病变或疑似肿瘤病料样本17份,以单管套式PCR方法检测禽白血病病毒长末端重复序列(LTR),15份病料均扩增出一条213 bp的DNA带,与预期扩增长度相符合,外源性禽白血病病毒的检出率达到88.2%.同时针对禽白血病病毒的囊膜糖蛋白基因(gp85)进行PCR扩增,在被检的17份病料中,7份检出J亚群特异性的DNA带(545 bp),占41.1%;9份检出A亚群特异性的DNA带(691 bp),占52.9%;其中2份病料同时检出J亚群与A亚群特异性的病原核酸.A、J亚群的PCR检出率低于LTR的套式PCR扩增. 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2014,(12)
为了建立特异、敏感、快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,针对支原体ompA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立鹦鹉热嗜衣原体TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。并对来自宁夏地区三个规模化奶牛养殖场的376份流产奶牛样品利用鹦鹉热嗜衣原体IHA诊断试剂盒和TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR进行检测。结果表明:建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法敏感性为10 fg的总DNA,是一种可靠、快速、灵敏的检测鹦鹉热嗜衣原体的方法,并且成功应用于奶牛鹦鹉热嗜衣原体样本的检测。 相似文献
8.
本试验根据GenBank发表的小鹅瘟病毒B株基因序列,设计了两对VP3基因的特异性引物,进行PCR扩增,建立了小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法,该方法能特异性地扩增出406 bp的小鹅瘟病毒VP3基因片段而对其他病毒基因组DNA均没有扩增出条带。本方法对病料中小鹅瘟病毒基因组DNA的最小检测量为0.02175 fg/μL。通过对延边地区疑似小鹅瘟的80只病死雏鹅进行了检测,阳性检出率为95%。结果表明,本试验建立的小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法具有极高的敏感性和特异性且检出率极高,可作为一种有效的临床诊断方法。 相似文献
9.
本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测。结果显示,该方法能扩增到297 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了105倍。本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等。 相似文献
10.
巢式PCR检测隐孢子虫卵囊的研究 总被引：13，自引：0，他引：13
隐孢子虫病是一种重要的人畜共患原虫病。为了在临床样品中更准确、快速地检测隐孢子虫卵囊,从初步纯化的含有不同数量隐孢子虫卵囊的样品中和含有不同数量隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中,直接提取DNA或用DNA纯化试剂盒对提取的奶牛粪便中卵囊DNA进行纯化之后用作起始PCR(Primary PCR)模板,以起始PCR的产物为模板进行巢式PCR(Nested PCR),用2对人工合成寡核苷酸分别作为两个PCR的引物,扩增片段大小分别为1325bp和820bp。优化了Mg2+浓度、引物浓度和dNTP浓度,并进行了特异性检验。建立的巢式PCR具有隐孢子虫属特异性,不仅扩增出新鲜样品DNA提取物中的目的片段,而且扩增出放置6年之久的DNA提取物中的目的片段。样品经过初步纯化之后,起始PCR和巢式PCR最低检测值卵囊分别为2 86×103个/ml和≤2 86个/ml;从含有隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中提取DNA,尔后经过DNA纯化试剂盒纯化,其起始PCR和巢式PCR粪便中卵囊最低检测值分别为2 86×107个/g和≤2 86个/g。有望发展为试剂盒。 相似文献
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为建立一种快速、敏感检测牛巴贝斯虫的方法,本研究根据GenBank中登录的牛巴贝斯虫rap-1基因保守区设计2对特异性引物,经反应条件的优化,建立了牛巴贝斯虫套式PCR检测方法。结果显示,该方法可以特异地检测牛巴贝斯虫,而对双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫和弓形虫的检测均为阴性;该方法的灵敏度可达1.3×10~1拷贝/μL,是牛巴贝斯虫荧光定量PCR检测试剂盒的10倍,是常规PCR的1 000倍。对50只扇头蜱和微小牛蜱DNA进行检测,套式PCR、牛巴贝斯虫荧光定量PCR检测试剂盒和常规PCR的阳性检出率分别为100.0%、72.0%和0。本实验建立的套式PCR检测方法适用于牛巴贝斯虫病的早期诊断和分子流行病学调查,为蜱传牛巴贝斯虫病的防控提供技术支持。 相似文献
12.
应用PCR检测隐孢子虫卵囊的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
隐孢子虫病是一种重要的人畜共患原虫病。为了在临床样品中更准确、快速地检测隐孢子虫卵囊，从初步纯化的含有不同数量隐孢子虫卵囊的样品中和含有不同数量隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中，直接提取DNA或用DNA纯化试剂盒对提取的奶牛粪便中卵囊DNA进行纯化之后用作PCR模板，用1对人工合成寡核苷酸作为PCR引物，扩增片段大小为452bp。优化了Mg^2 浓度、引物浓度和dNTP浓度，并进行了特异性检验。建立的PCR具有隐孢子虫属特异性，不仅扩增出新鲜样品DNA提取物中的目的片段，而且扩增出放置6年之久的DNA提取物中的目的片段。样品经过初步纯化之后，最低检测值100个卵囊／ml；从含有隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中提取DNA，尔后经过DNA纯化试剂盒纯化，PCR最低检测值为10^5个卵囊/g粪便。 相似文献
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为了建立一种准确、快速检测猪圆环病毒3型(PCV-3)的方法,试验根据GenBank中PCV-3基因序列设计合成了内、外两对引物,建立了套式PCR方法,并检验了该方法的特异性、敏感性、重复性,同时用该方法对124份临床疑似病料进行检测。结果表明:用建立的套式PCR方法检测PCV-2、PRV、PPV、PRRSV、CSFV、TGEV、PEDV,均为阴性,外引物PCR扩增的检测灵敏度为17 ng DNA,内引物PCR扩增的检测灵敏度为0. 17 ng DNA。用该方法检测124份临床病料样品,外引物共检测出阳性样品22份,内引物共检测出阳性样品28份,青海省部分地区PCV-3的感染率达22. 58%(28/124)。说明该套式PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,可以用于临床病料中低含量PCV-3的快速检测。 相似文献
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根据GenBank中马巴贝斯虫(Babesia equi)ema-1基因序列,设计合成内外2对引物,其中外引物扩增ema-1基因60～627nt间567 bp片段,内引物扩增ema-1基因259～488nt间229bp片段。从实验室感染马巴贝斯虫阳性马匹全血样本中提取DNA,采取2次扩增的方法,扩增到229bp特异性条带,建立了适合马巴贝斯虫快速检测的套式PCR方法。经重复性试验和特异性试验,结果显示,马巴贝斯虫阳性样本在229bp均出现条带,而驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫扩增结果为阴性。采用该方法对已知阴、阳性的16份马匹全血样品进行检测,有8份为阳性,与实际结果的符合率为100%。表明,所建立的方法具有较高的重复性和特异性,可用于马巴贝斯虫病的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查。 相似文献
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试验旨在快速有效地检测泌乳奶牛的二酰甘油转酰基酶1（diacylgycerol acyltransferase 1,DGAT1）乳脂量性状的优势等位基因K232A单核苷酸多态性,确定DGAT1基因型进而确定泌乳性状,为中国荷斯坦奶牛分子标记辅助选择提供技术支持。选取6头泌乳初期（3头为高乳产量牛,3头为低乳产量牛）中国北方荷斯坦奶牛为研究对象,提取乳腺组织基因组DNA,分别设计1对外引物和1对内引物,建立一种四引物ARMS-PCR体系快速检测奶牛乳腺组织DGAT1基因单核苷酸多态性。结果发现,外引物扩增片段长度为512 bp,为PCR反应的阳性对照,基因型为232K扩增片段长度为369 bp,基因型为232A扩增片段长度为181 bp。PCR结果显示,6头牛的乳腺组织样本均由外部引物扩增出长度为512 bp的片段,泌乳期高乳产量奶牛和泌乳期低乳产量奶牛乳腺组织的特异性扩增片段长度均为181 bp。表明本研究选取的6头奶牛样本DGAT1基因K232A多态性均为232A型。提示该PCR鉴定方法能够快速有效地鉴定奶牛DGAT1基因型,可用于中国荷斯坦奶牛分子标记辅助选择。 相似文献
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为寻求快速、有效检测羊泰勒虫的PCR方法,本试验建立了检测羊泰勒虫18SrRNA基因和表面蛋白基因的两种常规PCR方法和一种检测18SrRNA基因的半套式PCR方法,并从其敏感性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示:上述方法检测羊泰勒虫基因组DNA的最小检测量分别为1.6fg/μL、16fg/μL和0.016fg/μL;检测临床样本阳性检出率分别为31.37%(16/51)、17.64%(9/51)和45.10%(23/51)。3种方法中,检测18SrRNA基因的半套式PCR方法敏感性和临床样本检出率最高,其次为检测18SrRNA基因的常规PCR方法,最后为检测表面蛋白基因的常规PCR方法。结果说明,所建立的半套式PCR方法是一种较好的羊泰勒虫检测方法。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎PCR诊断方法的建立 总被引：12，自引：2，他引：10
根据已发表的猪胸膜肺炎放线杆菌APXIV毒素的基因序列，自行设计和合成了二对可扩增448bp和365bp目的片段的引物，成功的建立了检测APP的套式PCR方法。通过对猪肺疫巴氏杆菌、猪链球菌、大肠杆菌、猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体和猪丹毒杆菌的DNA进行了PCR检测，结果均为阴性；对猪胸膜肺炎放线杆菌的1、2、5、6、7、9国际标准血清型均扩增出448bp和365bp的特异性条带；检测的敏感度一步PCR可达到5OO个细菌，最低检出DNA浓度可达到0．585ng／mL；套式PCR可达到50个细菌，最低检出DNA浓度可达到58．5pg／mL。另外，对5株从病猪体内分离的猪胸膜肺炎放线杆菌进行了检测，5株均成阳性反应；对10只屠宰猪的肺脏分离物进行了检测，结果1份为阳性。结果表明此法特异性和敏感性均很高，可做为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断和流行病学调查的手段。 相似文献
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根据Genbank中发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,设计2对PCV2特异性引物,建立套式PCR检测方法。外测引物p1、p2扩增片段长度为647bp(92-738),内测引物p3、p4扩增长度为219bp(319-537)。其中用外部引物可扩增DNA含量到10-5mg/mL,而套式PCR则比普通PCR灵敏性还要提高103倍。用该方法对山东、安徽和河北10省的899份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测,结果有329份样品检测出阳性,平均阳性检测率达36.6%。由此可见,PCV2感染在全国范围内的发病猪群中普遍存在。 相似文献
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猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV)是2017年在我国广东首次发现的一种可导致新生仔猪急性水样腹泻及死亡的新型冠状病毒。为调查2018年江西及福建猪群中该病毒的感染情况,试验建立了一种SADS-CoV套式RT-PCR检测方法,并调查2018年江西及福建腹泻猪只样本中SADS-CoV的流行情况。根据GenBank数据库中SADS-CoV GDS04毒株(登录号MF167434)的核衣壳蛋白(N)基因核酸序列,设计了两对特异性套式引物。以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒等病毒的基因组为模板检测引物的特异性。通过优化反应条件建立了检测SADS-CoV的套式PCR方法,用建立的套式PCR方法对2018年从江西和福建两省8个猪场采集的492份腹泻样品进行检测。应用设计的两对套式引物扩增出了650 bp和291 bp两个特异性片段。试验建立的套式PCR检测方法特异性好,只能扩增SADS-CoV,其最低检测限度为102拷贝/μL。利用所建立的方法对来自江西和福建省的492份腹泻猪临床样品进行检测,从福建猪群样品中检出了2份SADS-CoV感染,未从江西临床样品中检出SADS-CoV。试验将为SADS-CoV的临床检测提供一种套式PCR检测方法,结果表明该病毒在福建猪群而未在江西腹泻猪群中流行,将对SADS-CoV的临床诊断等具有应用价值。 相似文献