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1.
狂犬病病毒核蛋白在Bac-To-Bac/AcMNPV杆状病毒系统的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为真核表达狂犬病病毒的核蛋白,本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因,将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中,构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-NP;通过转染昆虫细胞sf9包装重组杆状病毒。SDS-PAGE、western blot和间接免疫荧光对表达的蛋白进行鉴定和反应原性分析。分别以重组杆状病毒表达的核蛋白、原核表达核蛋白为包被抗原进行ELISA检测。结果表明,在昆虫细胞中表达的狂犬病病毒重组核蛋白能与鼠抗RV核蛋白单克隆抗体和RV阳性血清特异性结合,其相对分子量约为50.5ku。以重组杆状病毒表达的核蛋白为抗原建立的rNP-ELISA的敏感性、特异性、符合率分别为86.36%,89.83%,90.00%,优于大肠杆菌表达的RV核蛋白。说明杆状病毒系统表达的核蛋白是建立RV核蛋白ELISA抗体检测方法的理想抗原。 相似文献
2.
小反刍兽疫病毒N基因重组杆状病毒的构建及间接ELISA抗体检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：1
本研究旨在建立基于真核表达的小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的诊断小反刍兽疫的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫表达系统,构建含有PPRV N基因的重组供体质粒pFastBacHTA-N,转化E.coliDH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒pBacmid-PPRV-V,转染昆虫细胞Sf21,获得含有PPRV N基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出60ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid-PPRV-N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。临床检测来自西藏疫区的37份山羊血清和来自青海省非疫区的92份山羊血清,与法国蒙彼利埃农学发展研究国际合作中心(CIRAD-EMVT)提供的竞争ELISA试剂盒相比较,特异性为96.2%,敏感性为100%,二者的符合率达到96.9%。结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。 相似文献
3.
猴B病毒gB基因杆状病毒表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据B病毒E2490株(基因序列AF533768)人工合成猴B病毒gB基因,通过XbaI和EcoRI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切及测序鉴定,表明构建了猴B病毒gB基因杆状病毒表达重组质粒pFastHTA-gB。在此基础上,重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经平板抗性筛选,PCR鉴定,表明获得了转座的杆粒,为下一步进行昆虫细胞的转染和以猴B病毒gB蛋白为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
4.
《中国畜牧兽医文摘》2012,(5)
根据已报道的STLV病毒gag蛋白基因(genbank登录号:AY590142),人工合成猴STLV病毒gag基因,通过BamHI和HindIII特异性酶切,将其克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切及测序鉴定,成功地构建了猴STLV病毒gag基因杆状病毒表达重组质粒pFastHTB-gag。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经卡那霉素、庆大霉素、四环素平板抗性筛选,PCR鉴定,表明获得了转座的杆粒Bacmid-gag。在此基础上,提取Bacmid-gag杆粒,并转染Sf9昆虫细胞,96h后反复冻融细胞,收集上清液,获得杆状病毒,并用来Sf9细胞,收获目的蛋白。通过SDS-PAGE和westernbloting分析表明初步获得了表达的gag蛋白且具有良好的生物活性,大小约为52kD,为下一步以表达的gag蛋白为诊断抗原,替代现阶段以分离的病毒抗原和HTLV相关蛋白作为抗原的猴STLV病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
5.
将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应. 相似文献
6.
蓝舌病病毒VP7基因的原核表达 总被引：1，自引：1，他引：1
为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因的原核表达蛋白,本实验采用RT-PCR方法扩增出了血清1型BTV的VP7基因,并克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,构建了重组质粒pMAL-VP7.将重组质粒转化TBl感受态细胞,以0.5 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白MBP-VP7以可溶形式存在,分子质量约为90 ku.以纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立了检测BTV血清抗体的间接ELISA诊断方法,为今后进一步开展BTV诊断研究奠定了基础. 相似文献
7.
利用RT-PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)M和N结构蛋白基因,将其分别克隆入载体FastBacTM Dual,获得转移质粒pFastBacTM Dual-M和pFastBacTM Dual-N,将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-M和Bacmid-N;在Cellfection作用下,将杆状病毒重组质粒转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rBac-M和rBac-N。间接免疫荧光试验(IFA)检测表明,杆状病毒表达的M蛋白和N蛋白能够被特异性阳性血清识别,重组蛋白具有较好的反应原性。将重组杆状病毒rBac-M和rBac-N口服免疫小鼠,收集小鼠粪便检测抗TGEV sIgA抗体水平,采集血液检测血清中抗TGEV IgG。结果显示,重组杆状病毒(rBac-M和rBac-N)可诱导小鼠产生粘膜免疫和体液免疫应答。试验结果初步预示了杆状病毒经口服途径作为抗原递呈载体的可行性,也为开展TGEV口服免疫研究奠定了基础。 相似文献
8.
原核表达狂犬病病毒的基质蛋白(M),并以此作为包被抗原建立间接ELISA检测方法,与以狂犬病病毒磷蛋白(P)作为包被抗原建立的间接ELISA方法进行比较。根据GenBank中公布的狂犬病病毒LEP-Flury株M基因序列设计特异性引物并引入SmaⅠ和NotⅠ酶切位点,经RT-PCR扩增得到目的基因,连接pCR 2.1载体,构建重组质粒pCR-RV-M,重组质粒用SmaⅠ和NotⅠ进行双酶切,酶切产物定向克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-RV-M。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使用IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表明蛋白表达量较大,且主要以可溶性的形式表达。亲和层析纯化目的蛋白,Westernblot表明融合蛋白具有良好的反应原性,使用纯化的融合蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法并检测了95份血清,同时使用带有His标签的重组狂犬病病毒磷蛋白P(RV-His-P)建立的ELISA方法和商品化的ELISA试剂盒检测该血清。结果表明:与商品化的以全病毒作为包被抗原的ELISA检测试剂盒相比,使用重组P蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测方法具有更高的符合率,能够代替全病毒作为诊断抗原建立检测方法。 相似文献
9.
利用杆状病毒表达系统对Asia Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VPl基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白功能及建立Asia Ⅰ型FMDV血清学诊断方法奠定基础.采用PCR方法从pGEM-T-Easy-Asia Ⅰ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BaeHTA-VPl再转入DH10Bae感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Baemid-VPl,然后转染Sf9昆虫细胞.PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Baemid-VP1,SDS-PAGE和West-ern-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白.将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出Asia Ⅰ型口蹄疫病毒阳性血清.Asia Ⅰ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础. 相似文献
10.
《中国兽医杂志》2014,(10)
应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的血凝素蛋白,并对其抗原性进行鉴定。扩增小反刍兽疫病毒Tibet 07株H基因,克隆至p Fast Bac/CT-TOPO载体中,构建重组穿梭质粒p Fast Bac-PPRV-H,转化感受态大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆状病毒Bacmid-PPRV-H,转染sf9细胞,通过异源基因重组获得杆状病毒,通过病毒蚀斑试验检测扩增后病毒滴度。将P3代病毒以0.05MOI感染sf9细胞,通过SDS-PAGE鉴定H蛋白的表达,利用Western blot和间接免疫荧光鉴定H蛋白的抗原性。经过PCR、测序等证明重组杆状病毒Bacmid-PPRV-H构建正确。P2代重组杆状病毒的病毒滴度为1×107。表达的H蛋白在相对分子量约68 k Da处可见特异蛋白条带。感染的sf9细胞可与小反刍兽疫病毒H蛋白的单克隆抗体发生特异性反应。表明Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的血凝素蛋白,为进一步研究其生物学功能及构建检测ELISA试剂盒奠定了试验基础。 相似文献
12.
构建以伪狂犬病病毒Bartha-K61株为载体的正向表达狂犬病病毒(8202株)糖蛋白的重组活载体疫苗.将eGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Mlu Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,经酶切鉴定为正向连接,阳性重组子命名为p8AA-eGFP/rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得rPRV/eGFP/rgp重组病毒.对纯化后的重组病毒进行RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光鉴定.结果表明,重组病毒的滴度(TCID_(50))为10~(8.125)/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性;通过构建表达狂犬病病毒糖蛋白正向重组Bartha-K61的活载体疫苗的研制,为狂犬病疫苗的研制与开发奠定基础. 相似文献
13.
狂犬病病毒糖蛋白基因中和抗原表位在大肠杆菌中的串联表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法从狂犬病病毒HEP株中克隆狂犬病糖蛋白膜外区全长基因。利用突变PCR方法,将糖蛋白基因中三段中和抗原位点串联,克隆至pET-28a表达载体。阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导表达并确定最佳诱导条件。SDS-PAGE电泳结果显示所表达的蛋白大小与预期相符。经Western-blotting检测,串联表达的狂犬病糖蛋白基因中和抗原位点可与狂犬病标准阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。 相似文献
16.
P Desmettre B Languet G Chappuis B Brochier I Thomas J P Lecocq M P Kieny J Blancou M Aubert M Artois 《Veterinary microbiology》1990,23(1-4):227-236
A vaccinia rabies recombinant virus was constructed and shown to induce the synthesis of rabies virus glycoprotein in infected cells and to induce rabies virus neutralizing antibodies and protection in susceptible animals. Active when orally administered, this recombinant is a good candidate for the development of vaccines for wild animal rabies vectors. This recombinant was found stable, safe for target and non-target animal species, and protective for most of the rabies vectors. After extensive experimental studies conducted under controlled conditions, it as used in limited field trials and in an extensive open field trial. The preliminary results confirmed its basic properties and potential for rabies eradication. 相似文献
17.
经过PCR反应,以特异性引物扩增了禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00(H5N1)去除信号肽的HA基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTA中,阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染sf 9昆虫细胞,获得含H5亚型禽流感病毒HA基因的重组杆状病毒H5HA-Bac HTA。利用SDS-蛋白酶K方法提取重组病毒DNA,PCR反应证实HA基因片段已重组到杆状病毒基因组中。以适宜剂量的重组杆状病毒接种sf 9昆虫细胞,待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞。细胞裂解产物经间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western-Blot试验检测,结果表明:H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒H5HA-Bac-HTA感染sf 9细胞后获得高效表达,且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。 相似文献
18.
为了获得具有生物学活性的牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV） gD蛋白特异性单链抗体,试验采用PCR方法扩增杂交瘤细胞的cDNA单链抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因,通过重叠延伸PCR及Linker序列获得完整的单链抗体基因,将单链抗体基因克隆至杆状病毒载体pFB-LIC-Bse中,构建重组转移载体pFB-VH-VL,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒rBacmid-VH-VL,将重组杆粒rBacmid-VH-VL转染至Sf9细胞中获得携带单链抗体基因的重组杆状病毒。该重组杆状病毒在Sf9细胞中表达了分子质量约为30 ku的单链抗体蛋白。Western blotting结果显示,重组单链抗体蛋白能被His标签抗体特异性结合,也能特异性结合gD蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,该单链抗体蛋白能够识别感染牛肾细胞MDBK中的IBRV。本研究在昆虫细胞中成功表达了具有识别IBRV的gD蛋白特异性单链抗体,为牛传染性鼻气管炎的诊断与治疗奠定了基础。 相似文献
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为获得具有生物活性的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gE/gI蛋白,建立PRV抗体快速检测方法。将含有PRV gE、gI基因的质粒pFastBacdual-GP67-gE/gI转化至宿主菌,经位点特异性重组和蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-gE/gI,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。采用悬浮的Sf9细胞进行发酵并纯化产物,SDS-PAGE和Western blot分析镍柱纯化后的重组蛋白。结果显示,重组杆粒在4800 bp处克隆出预期大小的条带,表示重组杆粒构建成功。SDS-PAGE和Western blot表明,在50 ku和65 ku处出现预期大小的条带,能与PRV标准阳性血清特异性反应,不与PRV gE/gI缺失疫苗免疫血清反应。结果表明gE/gI重组蛋白具有良好的反应原性,为PRV抗体快速检测及区分PRV野毒感染和疫苗免疫奠定了基础。 相似文献
20.
For preparation of bioactive single chain fragment variable (ScFv) which was targeted against envelope glycoprotein D (gD) of infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV),VH and VL genes were amplified from the cDNA of lymphocyte hybridoma, then VH and VL genes were integrated with a Linker by SOE-PCR,and the ScFv gene was cloned into the baculovirus vector pFB-LIC-Bse, which was transformed into Escherichia coli DH10Bac competent cells to construct a recombinant bacmid rBacmid-VH-VL. Finally,ScFv was expressed by transfected rBacmid-VH-VL into insect Sf9 cells, its molecular weight was about 30 ku. The result of Western blotting suggested that ScFv generated in Sf9 cells was specifically binds to His antibody,the protein also showed high affinity to gD of IBRV. The result of indirect immunofluorescence assay showed that ScFv could recognize IBRV which infected bovine kidney cells (MDBK). The study indicated that the recombinant ScFv was expressed in Sf9 cells, and could bind to gD of IBRV specifically. The result could provide the basis for the diagnosis and treatment of infection of IBRV. 相似文献