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1.
为了表达猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3) Cap蛋白,按照昆虫细胞密码子偏嗜性对ORF2基因进行优化并在N端加上His标签基因,合成的ORF2基因片段克隆入pFastBac Dual杆状病毒穿梭载体;将重组质粒转化大肠杆菌DH10-Bac感受态后通过蓝白斑筛选获得重组杆粒Bacmid-C2;将重组杆粒转染至SF9细胞5 d后收集细胞上清液;连续传代3次观察细胞病变。将接毒后的SF9细胞样通过Western blot及间接免疫荧光(IFA)进行Cap蛋白表达的鉴定。利用蔗糖密度梯度离心对病毒样颗粒的Cap蛋白纯化后进行透射电镜观察。结果显示：SDS-PAGE和Western blot检测发现重组杆状病毒在昆虫细胞中能够有效表达Cap蛋白,且与His-tag单抗及PCV3阳性血清发生特异性反应;IFA进一步鉴定感染了重组病毒的昆虫细胞与His单抗产生特异性荧光;透射电镜可以明显观察到14～17 nm左右形态规则的病毒样颗粒(VLPs)。PCV3 Cap蛋白的成功表达和鉴定将为研究Cap蛋白的免疫原性和空间结构奠定基础,也为探讨开发PCV3的亚单... 相似文献
2.
《畜牧与兽医》2014,(6):1-8
在兔出血症病毒(RHDV)主要结构蛋白VP60的N端插入双串联卵清蛋白(OVA)CD8+T细胞表位(OVA第257-264位氨基酸),研究外源片段对VP60蛋白表达及病毒样颗粒(VLPs)装配的影响,分析VP60作为载体的可行性和对外源基因长度的耐受性。通过分子生物学方法将双串联OVA CD8+T细胞表位(257-264aa)插入至RHDV衣壳蛋白VP60基因序列的N端,得到重组VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,并命名为DN。经RT-PCR、间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western blot方法鉴定嵌合蛋白DN的表达,利用电镜观察嵌合蛋白病毒样颗粒的形成。结果表明嵌合VP60蛋白在杆状病毒表达系统中得到高效表达,且可形成与RHDV VLPs类似的病毒样颗粒。本研究为VP60作为载体系统,有效提呈外源片段的研究提供了重要依据,同时也为VLPs疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
3.
利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建了含有H3N8亚型马流感病毒HA、NA和M1蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)。VLPs的鉴定结果表明,3种蛋白正确组装出了类似于天然病毒粒子的形态结构,且具有血凝活性。将VLPs免疫马匹制备高免血清,分别设计小鼠先被动免疫再攻毒以及先攻毒再紧急注射免疫血清,结果证明马高免血清对H3N8亚型马流感病毒感染具有良好的预防和治疗效果,为研制H3N8亚型马流感VLP疫苗提供了理论依据。 相似文献
4.
马传染性贫血病毒(EIAV)gag基因编码的多聚Gag蛋白能够自动组装形成病毒样颗粒(VLPs)。为研究EIAV衣壳蛋白合成、组装及释放过程,本实验通过构建表达EIAV Gag-GFP融合蛋白重组质粒,并将其转染293T细胞,采用western blot检测不同时间点VLPs的产生及释放。并进一步通过活细胞和3D成像技术观察Gag-GFP在细胞中的表达动态及VLPs的组装过程。结果表明:Gag和GFP蛋白融合表达不影响VLPs的组装,转染约6 h后EIAV Gag蛋白进行合成并在细胞胞质聚集完成组装形成VLPs。该实验结果为进一步研究EIAV在细胞中的组装路线和机制奠定了重要基础。 相似文献
5.
为了利用同一重组大肠杆菌实现不同种动物疫病来源类病毒样颗粒(virus like particles, VLPs)的高效组装表达,试验将编码猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白的核苷酸序列分别克隆至pET28a-Rcodon载体中,并分别转化至改造的BL21(DE3)△lpxM tig+感受态细胞中,利用纳米粒度电位仪及透射电子显微镜分析目的蛋白表达后的胞内组装情况,并用纯化后的抗原蛋白制备的疫苗免疫动物进行免疫效力评价。结果表明：PCV2 Cap蛋白和IBDV VP2蛋白的可溶性表达水平较优化前对照组均分别提高90%左右,且目的蛋白在胞内高效自组装形成了VLPs,并排列呈均一的晶格结构;含VP2抗原的亚单位疫苗可提供100%的保护效果,含PCV2抗原的亚单位疫苗的抗体水平较高,显著高于阴性对照组纯化后的抗原蛋白制备的疫苗(P<0.05)。说明PCV2 Cap蛋白和IBDV VP2蛋白在BL21(DE3)△lpxM tig+感受态细胞中均可实现高效可溶性表达与细胞内VLPs自组装,且免疫原性良好... 相似文献
6.
根据昆虫细胞密码子的偏嗜性,对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)VP2基因的密码子进行优化,利用Bac-to-Bac表达系统构建了表达优化VP2基因的重组杆状病毒,通过感染昆虫细胞(Sf9)获得病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。SDS-PAGE分析显示Sf9细胞中出现了65 kDa的蛋白条带,间接免疫荧光(indirect immunofluorescent assay,IFA)和Western blot结果均证实表达产物能与鼠抗GPV VP2抗体发生特异性反应,说明其具有良好的免疫反应性。同时,试验结果还证明,密码子优化后的GPV VP2基因在昆虫细胞中表达量得到了提高,明显高于野生型VP2基因。透射电镜观察纯化后的昆虫细胞表达产物,可见直径约30 nm的VLPs,表明密码子的优化并不影响VP2蛋白的组装。本研究为进一步研制诊断抗原以及新型GPV疫苗等奠定了基础。 相似文献
7.
人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)是近年来暴发危害较严重的手足口病的病原。利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕卵巢培养细胞(Bm N)中共表达EV71病毒衣壳蛋白VP1与VP2,分析二者组装成病毒样颗粒(VLPs)的效率,比较用不同启动子构建重组病毒的表达效果,并利用家蚕幼虫进行2种蛋白质的共表达及VLPs纯化条件的研究。结果表明,重组病毒v Bm Bac-vp1-vp2与v Bm Bac-vp1-IRES-vp2均可介导EV71的VP1、VP2蛋白在Bm N细胞中表达,并能够组装成病毒样颗粒,但采用Pph及Pp10启动子的表达和组装效率明显高于Pph及IRES启动子组合;将重组病毒v Bm Bac-vp1-vp2以1×10~4TCID_(50)/头的剂量注射5龄起蚕,Western blotting检测到VP1在幼虫血淋巴中特异性表达,并且随着感染时间的延长表达量增加;经蔗糖梯度密度离心能够有效地纯化蚕体血淋巴中的病毒样颗粒。研究结果为后续EV71疫苗研制奠定了一定的试验基础。 相似文献
8.
RNA病毒引发了众多的人类、动物重大疫病和公共卫生事件,然而目前尚无针对RNA病毒的特效药物,开发安全且有效的疫苗是控制RNA病毒感染的最有效手段,新型疫苗研发和使用已经是第3次疫苗革命的主题。病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)是病毒的一种或几种结构蛋白构成的纳米级空心颗粒,不含有感染性遗传物质,无法自我复制,具有较高安全性。另外,VLPs形态结构与天然病毒粒子类似,保留了天然病毒粒子的空间构象,易被宿主免疫系统有效的识别、摄取和递呈,进而高效地诱导T细胞和B细胞的免疫反应,是近年来新型疫苗领域中的研究热点。现对RNA病毒结构与功能、VLPs疫苗的分类、包装与嵌入、表达系统及载体动能、免疫原性评价、蛋白定量及纯化等方面进行综述。 相似文献
9.
新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病,以呼吸道、消化道及神经系统症状为主要特征,在易感家禽中死亡率高达100%,给中国及世界养禽业和贸易往来带来了严重的经济损失。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是由病毒蛋白在感染过程中体外表达或自发组装而形成的不含病毒基因组、不能复制、不具有感染能力的病毒样蛋白颗粒。VLPs适宜的大小及独特的表面结构可被天然免疫细胞和分子有效识别,诱导良好的先天性免疫应答和适应性免疫应答,且VLPs不含病毒的感染性核酸,安全性较高,近年来成为疫苗领域中的研究热点。树突状细胞(dendritic cells,DCs)作为专职抗原递呈细胞,在连接天然免疫与适应性免疫之间具有独特功能,是目前抗原递呈能力最强的专职免疫细胞。成熟DCs (mature DCs,mDCs)迁移至次级淋巴组织能刺激初始型T细胞活化和增殖,被认为是特异性免疫应答的始动者,体外培养的不成熟DCs (immature DCs,imDCs) 也可辅助增强抗原递呈能力。NDV-VLPs主要是以NDV-M蛋白为骨架,来装配HN、F和NP蛋白,可表现出与活的NDV颗粒相似的外观和免疫原性。可见通过NDV-VLPs制成的疫苗同样具备安全、稳定、可刺激体液和细胞免疫应答、作为载体表达其他抗原及可设计成区分自然感染与免疫接种等诸多优点。文章主要就NDV-VLPs的相关内容展开探讨,以期为后续研究提供参考。 相似文献
10.
病毒样颗粒疫苗的研究进展 总被引：2，自引：0，他引：2
病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒,没有病毒核酸,不能自主复制,在形态上与真正病毒粒子相同或相似,俗称伪病毒、假病毒.VLPs有3个突出的优势:第一,以化学交联或基冈工程的方法对其表面进一步修饰和改造;第二,VLPs可包裹分子质量及电荷适中的核酸或非核酸分子;第三,多数病毒的VLPs在真核表达系统及少数病毒的VLPs在原核表达系统巾都能够有效地实现自我组装. 相似文献
11.
《中国兽医学报》2017,(7):1237-1242
新城疫和禽流感是严重危害养禽业的两大动物疫病,其中基因Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)仍是当前的主要优势流行株。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是由病毒结构蛋白装配而成的空心颗粒,不携带核酸,具有良好的安全性和免疫原性。本试验将AIV HA胞外域与NDV F基因胞内、跨膜域融合构建FcH9融合序列;进一步通过利用昆虫杆状病毒表达系统构建含有FcH9序列的重组杆状病毒rBV-FcH9,与实验室已构建rBV-M和rBV-HN共感染Sf9细胞,收集感染细胞上清,经蔗糖密度梯度离心法纯化嵌合VLPs。血凝血抑试验结果显示嵌合VLPs中HN和HA效价均为28;Western blot分析表明该VLPs可以与特异性阳性血清发生反应;透射电镜观察该VLPs具有典型的病毒粒子结构正,形态大小与野生型NDV相似。结果表明:本试验成功制备了包含有HN和HA蛋白的嵌合VLPs,为研制新型NDV-AIV二联疫苗候选株奠定基础,并为当前新城疫与H9N2亚型禽流感的防控提供策略。 相似文献
12.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(11)
为了利用大肠杆菌系统可溶性表达貉细小病毒(Raccoon dog parvovirus,RDPV)的衣壳蛋白VP2,获得RDPV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),试验首先通过密码子优化并合成RDPV VP2基因,构建重组表达质粒pET30a-VP2,转化至E.coli ER2566感受态细胞中;SDS-PAGE电泳检测目的蛋白RDPV VP2的表达形式;将重组表达质粒pET30a-VP2与分子伴侣质粒pTf16共同转入E.coli ER2566感受态细胞中,并优化最佳诱导表达条件;采用Western-blot技术鉴定目的蛋白的可溶性;经硫酸铵初级纯化后,电镜观察VLPs的形态,并采用血凝试验检测其免疫活性。结果表明:目的蛋白RDPV VP2得到了大量表达,并且大部分以可溶性形式表达,最佳诱导条件为30℃、0.1 mmol/L IPTG和2.0 g/L L-阿拉伯糖;犬细小单克隆抗体可以特异性识别目的蛋白RDPV VP2;30%硫酸铵沉淀初级纯化后,电镜观察可见到均一的、大小为24 nm左右的RDPV VLPs,其形态学结构与天然RDPV VLPs形态相似,血凝效价为2~(23)。说明分子伴侣可有效提高目的蛋白RDPV VP2的可溶性表达量,并成功制备出RDPV VLPs。 相似文献
13.
为了分析猪圆环病毒2b型病毒样颗粒(virus-like particles of Porcine circovirus type 2b, PCV-2b VLPs)表面具有外源肽展示潜力的位点,试验通过PyMol软件分析了PCV-2b VLPs表面的位点分布,并以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Gp5的中和表位B(Epitope B, EpB)为外源肽,通过重叠PCR方法将表面位点替换为EpB,构建EpB嵌合的PCV-2b衣壳蛋白(Cap),利用原核表达系统诱导表达后进行凝胶层析纯化和Western-blot检测,并利用透射电子显微镜分析VLPs的组装状态。结果表明：在PCV-2b VLPs表面共筛选到8个可用于外源肽展示的位点,分别为S1(Y50TIKRTTVKTP60)、S2(L75PPGGGSN82)、S3(F124VTKATAL131)、S4(V161LDSTIDY168)、S5(Q 相似文献
14.
《中国兽医学报》2017,(8)
新城疫病毒样颗粒(NDV VLPs)是由基质蛋白(M)为病毒骨架,装配血凝素-神经氨酸酶和/或融合蛋白等。已有研究表明,NDV VLPs能诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答。然而,关于NDV VLPs如何激活天然免疫应答的研究尚无报道。树突状细胞(DCs)作为专职抗原递呈细胞,在连接天然免疫与适应性免疫之间具有独特功能。本试验以NDV VLPs与小鼠DCs为研究靶点,将NDV VLPs(M+HN)刺激DC以评价DC成熟表征。结果显示该颗粒可被DC有效吞噬并递呈给初始型T细胞,诱导DC表面MHCⅡ和共刺激分子显著上调以及促进DC分泌促炎性细胞因子。另外,还发现不同组装类型的NDV VLPs对诱导DC分泌炎性细胞因子水平不一。结果表明,NDV VLPs可诱导DC成熟,这对更好地理解VLPs激活的天然免疫应答奠定基础,并且为优选NDV VLPs候选株提供参考依据。 相似文献
15.
为建立猪圆环病毒2型(PCV2)山西流行毒株Cap蛋白的原核可溶性表达体系,并分析比较重组蛋白与2种商品化基因工程Cap亚单位疫苗在小鼠体内不同阶段的免疫原性,本试验以PCV2e SXJX株(GenBank登录号：MH922991.1)的ORF2基因为基础,根据大肠埃希菌密码子偏性优化序列,将其插入原核表达载体pET-28a-c(+)中,鉴定为阳性后转入宿主菌BL21(DE3)中,经优化表达条件后,对超声破碎后的菌体上清进行纯化,分析纯化后产物的纯度和抗原性,并利用负染透射电镜观察重组Cap蛋白体外自组装成病毒样颗粒(VLPs)。分别将同等免疫剂量的PCV2e重组Cap蛋白和2种商品化PCV2基因工程亚单位疫苗免疫健康BALB/c雌鼠,应用ELISA方法检测不同阶段小鼠体内特异性抗体的水平。结果显示：重组Cap蛋白可在大肠埃希菌中表达,以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中,表达产物纯化效果良好,并能被PCV2单克隆抗体识别;透射电镜观察结果发现,表达的重组Cap蛋白可以自组装成约20 mm大小的VLPs;动物免疫试验结果显示,在首免后第21天PCV2e Cap试验组抗体水平显... 相似文献
16.
利用原核表达载体pET28a和pColdⅠ与猪细小病毒VP2基因分别构建重组表达质粒，并采用与伴侣蛋白共表达和低温诱导表达猪细小病毒VP2蛋白，并以电镜观察、血凝效价测定等进行鉴定。结果显示，2个表达载体均能对重组蛋白进行可溶性表达。冷休克载体组pColdⅠ-VP2蛋白在上清中表达效率更高且杂蛋白较少，诱导时不需要额外添加L-阿拉伯糖，表达过程工艺相对更简单。纯化后的pColdⅠ-VP2蛋白具有一定的免疫反应性，能在体外组装成病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),且具有血凝活性，使用206佐剂混合乳化重组蛋白免疫豚鼠后，血清中能检测到高滴度血凝抑制抗体。上述结果为进一步研究新型安全高效的猪细小病毒疫苗提供了数据支持。 相似文献
17.
18.
《中国兽医学报》2016,(4)
对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒样颗粒(VLPs)的免疫原性进行了探讨,并将其与鸡传染性法氏囊病活疫苗进行比较。分别用VLPs及VLPs+Poly IC对14日龄非免鸡进行免疫,并用IBDV B87株弱毒商品疫苗作为阳性对照,同时设置空杆粒蛋白组作阴性对照及PBS对照。免疫前进行颈静脉采血,首免后每隔1周进行3次采血,通过间接ELISA抗体水平检测、中和试验和淋巴细胞增殖试验来进行分析比较。抗体水平检测结果显示,首免后第7天,在鸡的体内可检测到IBDV特异性抗体的组别为:VLPs组、VLPs+Poly IC组和B87株组,且在加强免疫后,抗体水平明显增高(P0.05)。首免后第14天,在3组鸡的体内均检测到高水平的抗IBDV中和抗体,且呈快速增长趋势。淋巴细胞增殖试验结果显示,VLPs组、VLPs+Poly IC组和B87株组鸡体内淋巴细胞增殖动态明显高于接种PBS和空杆粒蛋白组的鸡(P0.01),并且在加强免疫后明显提高(P0.05)。动物攻毒保护试验结果显示,攻毒后第2天PBS组和空杆粒蛋白组的鸡均表现出IBD的典型临床症状和病理变化且在攻毒后第6天全部死亡,VLPs组鸡的存活率为88.7%;VLPs+Poly IC组鸡存活率为80%;B87疫苗组鸡存活率为88.7%。器官指数分析结果显示,3组与空白组相比差异不显著(P0.05)。本试验制备的鸡传染性法氏囊病病毒样颗粒疫苗能够诱导机体产生较高水平的体液和细胞免疫应答,具有良好的应用前景。 相似文献
19.
猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒在伪狂犬病病毒表达系统中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
利用PCR技术从猪细小病毒（PPV）SC1株基因组中扩增VP2全基因,并将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中,构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病毒（PRV）SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞,待出现细胞病变后收集病毒液。经空斑纯化,并同时采用检测PPV VP2基因的PCR方法筛选获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光,表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中,并获得表达。进一步电镜观察表明,感染PRV SA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV 2种类病毒样颗粒。结果表明,成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒,为进一步研制PPV病毒样颗粒疫苗奠定了基础。 相似文献
20.
《中国兽医学报》2017,(2):218-223
采用融合PCR方法将猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因和人单纯疱疹病毒Ⅰ型病毒(HSV-1)VP22蛋白转导域串联得到Cap-VP22基因,将其插入到杆状病毒转移载体pFastBac Dual构建pFast-Cap-VP22重组转移载体,通过转化含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含Cap-VP22基因的重组穿梭质粒rBac-2Cap-VP22。重组穿梭质粒转染昆虫细胞(Sf9),获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞,通过PCR、间接免疫荧光(IFA)、电镜观察对表达产物进行检测。结果表明,成功构建含双拷贝Cap-VP22基因的杆状病毒载体,IFA证实重组蛋白在Sf9细胞中获得正确表达,与PCV2阳性血清具有良好的反应原性;电镜观察结果显示细胞上清中的目的蛋白可装配形成直径约17nm的病毒样颗粒(VLPs);表明C端融合VP22蛋白转导域序列并不影响Cap蛋白的组装。本研究为进一步研制安全、高效的PCV2疫苗奠定基础。 相似文献