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为建立羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)核酸的快速检测方法，本研究根据ORFV B2L基因保守序列设计特异性引物，通过优化反应温度与时间初步建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的ORFV检测方法。优化试验结果显示：该方法在37℃反应40 min检测效果最佳。采用该方法对ORFV、山羊痘病毒、O型和A型口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、山羊副流感病毒3型等临床常见症状相似的病毒核酸检测，结果显示：该方法除对ORFV的检测结果为阳性外，对羊的其他病毒的检测结果均为阴性，特异性较强。将质粒标准品10倍倍比稀释(1×109拷贝/μL～1×100拷贝/μL)后为模板，利用本研究建立的RAA方法检测，结果显示：该方法对ORFV质粒标准品的最低检测限为1×104拷贝/μL，敏感性较高。利用本研究建立的方法对95份临床样品(15份组织样品和80份血液样品)检测，结果显示：该RAA方法能够对临床样品快速检测，组织样品和血液样品的阳性率分别为33.33%(5/15)和6.25%(5/80)，该检测结果与普通PCR检测方法的符合率均为... 相似文献
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为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同) PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×101拷贝/μL～8.3×108拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I ... 相似文献
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采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型 (porcine circovirus 2,PCV2) 衣壳蛋白（capsid protein,CAP）基因,构建了重组质粒p-18T-CAP,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2 ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针,通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T-CAP为标准品进行TaqMan荧光定量PCR扩增,建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法与猪圆环病毒 1 型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应;该方法最低可检测到4.53×102拷贝/μL,比PCR检测方法高100倍;其标准曲线线性范围是102～109拷贝/μL,且具有良好的重复性。 相似文献
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旨在建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)的方法，并实现对AEV绝对定量检测。根据已发表的AEV的VP1基因为靶序列，在其保守区域内设计了特异性扩增的引物和探针序列，应用合成的引物和探针建立ddPCR检测AEV方法，并测定其特异性、灵敏性和重复性。结果显示，建立方法的最佳引物终浓度为1.0μmol/L,探针终浓度为0.5μmol/L,退火温度为58℃。特异性测试结果，本方法只检出AEV,没有检出禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽偏肺炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，且无交叉反应。灵敏性结果显示，本方法对pMD18-AEV重组质粒DNA最低检测限为5.9拷贝/μL,敏感性高。用4个连续稀释的pMD18-AEV重组质粒DNA的拷贝数的对数值与ddPCR检测的拷贝数的对数值绘制绝对定量曲线，其曲线呈良好的线性关系(R2=0.999 4),结果稳定。3次重复检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对采集的病鸡临床样品65份进行ddPCR和荧光定量PCR检测，结果... 相似文献
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为建立鉴别检测鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)及鸭圆环病毒(DuCV)的方法，本研究分别针对GPV、MDPV NS基因与Du CV Rep基因，设计特异性引物和Taq Man探针，经优化反应条件，建立了同一体系中同时鉴别检测GPV、MDPV及Du CV的Taq Man荧光定量PCR方法。利用该方法检测GPV、MDPV、Du CV及禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒、鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒等主要水禽源病毒，结果显示，该方法仅能扩增出GPV、MDPV及Du CV，与其他主要水禽源病毒均无交叉反应，特异性强；利用该方法检测等体积混合后的GPV、MDPV及Du CV质粒标准品混合物，结果显示，该方法对3种质粒标准品的检测限均为7.5×101拷贝/μL，普通单一PCR对上述3种质粒标准品混合物的检测限均为7.5×103拷贝/μL，表明本研究建立方法的敏感性高于普通PCR；该方法组内与组间重复性试验的变异系数均小于2.0%，重复性好。利用该方法与MDPV和GPV双重荧光定量PCR方法及Du CV荧光定量PCR方法同时检测... 相似文献
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为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法，本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针，以GETV (SC483株) cDNA作为模板，扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中，构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经PCR和测序鉴定。基于该质粒标准品，采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度，初步建立了一种基于GETV nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，并绘制标准曲线。以GETV (SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板，利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测，结果显示，仅GETV为阳性，SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性，表明该方法特异性较强；分别以10倍倍比稀释(3.07×10-1拷贝/μL～3.07×108拷贝/μL... 相似文献
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猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×108至2.0×102拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。 相似文献
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牛纽布病毒(bovine nebovirus, BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原，为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法，本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针，并通过优化反应体系，成功建立了BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并对临床样品进行检测。结果表示，该方法最佳上下游引物浓度均为500 nmol/L,探针浓度为400 nmol/L,在1×108～1×101拷贝/μL之间呈现良好的线性关系，线性相关系数R2=0.996,扩增效率为105.9%;该方法特异性较强，在多个犊牛腹泻相关病原中，只检测出BNeV;敏感性较高，对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×101拷贝/μL,而普通PCR对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×103拷贝/μL;重复性较好，组内变异系数和组间变异系数均小于3%;对2021年3-5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BNeV的检出率为35.1%,... 相似文献
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为建立特异性强且敏感性高的兔源F型多杀性巴氏杆菌(Pm)快速检测方法，本实验根据F型Pm fcbD基因的保守序列设计特异性引物和探针，经反应条件优化，建立了检测兔源F型Pm的荧光定量PCR方法。利用该方法检测兔源F型Pm、兔源A和D型Pm、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌等临床常见兔源病原菌，结果显示，该方法仅对兔源F型Pm检测为阳性，其余病原菌均为阴性，特异性强。利用该方法分别检测10倍倍比稀释(1×108拷贝/μL～1×100拷贝/μL)的兔源F型Pm基因组DNA，进行敏感性试验，结果显示该方法的检测限为10拷贝/μL，敏感性分别是已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的100倍和10倍，敏感性高。利用该方法对不同稀释度的质粒标准品进行批内和批间重复性试验，结果显示，批内和批间变异系数均小于3%，重复性好。利用该方法检测64份已知结果的临床样品，结果显示该方法的检测结果与已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法检测结果的符合率均为100%，准确性高。本研究首次以fcbD为靶基因建立兔源F型Pm的荧... 相似文献
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为建立微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）定量检测鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）方法,以MG的mgpc基因序列为目的序列,在其保守区域内设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过各反应条件优化,建立了检测MG的ddPCR方法,并测定了建立方法的特异性、敏感性以及重复性。结果显示：建立方法的最佳引物浓度为20 μmol/μL,探针浓度为10 μmol/μL,退火温度为55 ℃;该方法只检出MG,没有检出鸡滑液囊支原体、禽衣阿华支原体、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽偏肺炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌,且相互间没有交叉反应;本方法最低检测MG重组质粒标准品的检测限为3.9拷贝/μL。重组质粒标准品浓度在3.9~41 025拷贝/μL范围内,绘制的ddPCR绝对定量曲线与测得值呈良好的线性关系（R2 = 0.999）;3次重复检测试验结果的变异系数均小于5%。对采集的60份病鸡喉拭子、气囊拭子及肺样品进行MG检测,结果ddPCR方法的阳性检出率（15.0%）高于荧光定量PCR方法（13.3%）。结果表明,本研究建立的ddPCR方法定量检测MG特异性强,灵敏度高,重复性好,为绝对定量检测MG提供了技术手段。 相似文献
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为建立检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,本试验克隆了鸭痘病毒P4b基因,构建重组质粒pMD-DPV-P4b,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的禽痘病毒P4b基因设计合成1对特异性引物及与该引物相匹配的特异探针。以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-DPV-P4b为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了一种检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法与禽流感病毒、鸭黄病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒和小鹅瘟病毒等其他水禽病毒,以及山羊痘病毒和鸡痘病毒等其他痘病毒均无交叉反应,特异性好。该方法最低检测限为1.29×102拷贝/μL,比普通PCR检测方法高100倍。组内和组间变异系数均小于2%。结果表明,本试验所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适用于鸭痘病毒的检测。 相似文献
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为建立反刍动物埃立克体(E.ruminantium)准确定量的微滴数字PCR方法(ddPCR)，本研究以E.ruminantium p CS20基因为靶基因，选取保守区域设计引物和探针，建立了E.ruminantium dd PCR方法。利用本研究建立的dd PCR方法检测E.ruminantium、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、无形体、犬埃立克体、牛埃立克体、马埃立克体和立氏埃立克体等，结果显示仅E.ruminantium出现特异性扩增，而与其他寄生虫均无交叉反应，特异性强；将p UC57-p CS20重组质粒标准品10倍倍比稀释(1×10-1拷贝/μL～1×105拷贝/μL)后，利用该dd PCR方法检测，结果显示，该方法对重组质粒标准品的检测限为1.8拷贝/μL，比相应荧光定量PCR方法的敏感性高10倍，本实验建立的dd PCR方法敏感性高；批内和批间重复性试验结果变异系数(CV)均小于2%，重复性好。利用建立的dd PCR方法对50只钝眼蜱样品检测，结果显示，阳性样品反刍动物埃立克体核酸的最低拷贝数为26拷贝/μL,dd PCR和荧光定量PCR检测试剂盒的检出率均为1... 相似文献
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为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,CIAV的Ct阈值与标准品浓度在5.33×108至5.33×103拷贝/μL间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.998,斜率为-3.443,产物Tm值在86℃左右。该方法与网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)J亚型、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组均无交叉反应,敏感性为5.33拷贝/μL,比普通PCR高1 000倍,批内和批间重复试验变异系数均小于3%。结果表明,本试验建立的CIAV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可实现对鸡传染性贫血病的早期诊断及感染程度的定量分析的检测。 相似文献
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为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×101~3.31×107拷贝·μL-1模板量时,呈良好的线性关系,相关系数（R2）为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×101拷贝·μL-1,组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为106.7、105.3拷贝·mL-1。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。 相似文献
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猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV。目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针。经过各反应条件的优化,初步建立了一种便捷、灵敏、能够快速准确检测PPV7的荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、稳定性以及与SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的符合率进行检测与对比。结果显示,该方法除对PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及PPV1核酸均无交叉反应,特异性较强。该方法对重组质粒标准品检测限为1.76拷贝/μL,而常规PCR方法检测限为1.76×102拷贝/μL,表明本研究建立的方法敏感性较高。该方法对不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验变异系数均小于1.7%,重复性较好。利用本研究建立的qPCR方法和SYBR Green Ⅰ qPCR方法对采自福建地区的150份样品进行检测,结果显示,两种检... 相似文献
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为建立兔多杀性巴氏杆菌(Pm)和兔出血症病毒(RHDV)的双重PCR检测方法，本研究根据Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域，设计2对特异性引物，经PCR分别扩增Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域，构建重组质粒p MD-Pm和p MD-RHDV，并经菌液PCR和测序鉴定后作为重组质粒标准品。经各反应条件优化后初步建立了检测Pm和RHDV的双重PCR方法。反应条件优化结果显示，该方法的最适退火温度为59℃，扩增kmt1和VP60基因的最优引物浓度均为0.5μL (10μmol/L)。对Pm和RHDV及其他病原包括兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种相关病原的特异性试验结果显示，除Pm和RHDV有特异性扩增条带外，其余相关病原均无扩增条带，特异性较强。将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后作为模板，经该双重PCR方法扩增。结果显示，该方法对p MD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL，对p MD-RHDV的检测限为1 260拷贝/μL，敏感性较高；对两种病原的DNA和cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致，重复性较好。对100份临床... 相似文献
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为建立Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,参考Gen Bank中已发布的禽腺病毒的六邻体基因(Hexon)序列设计两对引物,通过PCR扩增出Hexon基因的954 bp目的片段,克隆至p MD-19T载体,提取阳性质粒测定浓度,10倍系列稀释作为荧光定量PCR的标准品模板,制备标准曲线。结果显示,荧光定量PCR熔解曲线峰值单一,产蛋下降综合症病毒(EDSV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)等外源病毒均无扩增曲线出现,对标准品模板最低检出值为1.2×101拷贝/μL。对7份Ⅰ群4型禽腺病毒的细胞培养物的检出率为100%,表明建立的实时荧光定量PCR检测方法准确可行。 相似文献
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为建立快速、敏感、特异的评价猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）活疫苗中病毒含量的方法,根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因序列设计合成了标准品引物和定量引物,RT-PCR扩增PRRSV基因片段并连接到pMD19-T载体上,构建标准品质粒pMD19-T-PRRSV。采用SYBR GreenⅠ染料法进行荧光定量PCR检测,分析标准曲线并进行特异性、稳定性、重复性试验。结果显示,该方法检测病毒含量为7.43×100～7.43×108拷贝/μL,标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值之间相关系数高(R2=0.9989),引物特异性强。应用该方法对6个厂家PRRS活疫苗中的病毒含量进行测定,发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量差异较大,最高差异可达47.9倍。本试验建立的检测PRRS活疫苗病毒含量的荧光定量PCR方法可用于疫苗生产过程中及免疫动物前疫苗质量的评价。 相似文献
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《上海畜牧兽医通讯》2015,(4)
为了建立一种快速的鸡马立克氏病血清1型病毒(MDV-1)病原检测方法,试验采用针对MDV-1基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性的探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测MDV-1核酸的荧光定量PCR方法。优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和J亚群禽白血病病毒(ALV-J)均不发生交叉反应;该方法可检测到4.6×101拷贝/L的病毒核酸,与常规PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。研究结果表明所建立的Real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于MDV-1的定量检测。 相似文献