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猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸序列设计1对引物,用RT—PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白（N）基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T．1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31（DE3）感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT—PCR扩增,得到一段392bp的片段,与预期结果一致。SDS—PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39．866Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10％的SDS—PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。 相似文献
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对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列，设计合成了1对特异性引物，对SARS病毒N蛋白基因进行了RT—PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pGEM—N，进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp，编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比，核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100％。将pGEM—N双酶切．回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pE328a中，构建了重组质粒pET—N；将其转化表达菌BI21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS—PAGE结果表明：重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Westem—blotting证实，重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析，重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43％。 相似文献
3.
为制备猫冠状病毒（feline coronavirus, FCoV）核衣壳（nucleocapsid, N）蛋白的特异性抗体，本研究将Ⅰ型FCoV(ZJU1709)的N蛋白基因全长c DNA亚克隆到pCold TF原核表达载体上，通过低温诱导表达、镍柱亲和纯化获得可溶性重组N蛋白；进一步以纯化的重组N蛋白为免疫原制备兔多克隆抗血清（多抗血清），再通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、蛋白质印迹法（Western blotting, WB）、间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay, IFA）等多种方法对兔多抗血清进行反应性鉴定。结果显示：经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG）和低温诱导，成功表达出分子量约为100 kDa的可溶性重组N蛋白，在非变性条件下亲和纯化获得的重组N蛋白质量浓度达到1.4 mg/mL;N蛋白兔多抗血清的ELISA效价可达1×106，与真核表达的重组蛋白Flag-N以及FCoV... 相似文献
4.
根据NDVLaSota株F基因已知的抗原表位,对F蛋白进行分段表达。应用RT—PCR方法分段扩增F基因,并将其克隆到pET30a（＋））原核表达载体上,得到重组质粒pET30-F780和pET30-F760,将质粒导人BL21（ED3）感受态中,经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白通过SDS—PAGE和Westem—blotting方法进行鉴定。表达的两段蛋白大小约为31．1kDa和27．9kDa,与预期的蛋白分子量大小相符。Westernblot分析表明重组蛋白可以和NDV抗体发生特异性反应。成功构建了原核表达质粒pET -F780和pET—F760并获得了高效表达,通过Westernblot分析表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。 相似文献
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根据GenBank已发表的鸡γ干扰素（ChIFN-γ）eDNA基因序列设计一对引物,以ConA刺激8h后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板．通过RT—PCR方法克隆出ChIFN-γ基因,将其连接到pMD18-T载体上获得阳性重组质粒。测序结果表明,该ChIFN-γ与GenBank上发表的ChIFN-γ序列的同源性可达99．6％,其含有1个495bp的开放性阅读框架,编码164个氨基酸。通过KpnⅠ和NotⅠ两个酶切位点将该基因插入酵母表达载体（pPICZa—A）,并将该重组酵母ChIFN-γ载体线性化,通过电转化使ChIFN-γ基因整合到酵母（X-33）基因组上,经甲醇诱导后,成功表达出ChIFN-γ。利用Western—blotting分析测定表达的ChIFN-γ蛋白的活性。结果表明,本试验得到的重组酵母ChIFN-γ是具有反应原性的蛋白。 相似文献
7.
[目的]获得高表达量的蛋白,为进一步研制单克隆抗体提供较好的免疫原,同时也可为TLR7胞外区该片断蛋白未知区域的结构和功能研究奠定基础。[方法]应用PCR技术从重组质粒pcDNA3．1／CT-GFP-pTLR7上扩增出编码猪TLR7基因胞外区N端第27—202位氨基酸序列,利用BamHI和HindⅢ酶切位点将其插入到原核表达载体PE130a中,重组质粒转化BL21（DE3）后,在不同条件下诱导表达。[结果]经SDS．PAGE分析表明,重组菌表达出约26kD的融合蛋白,并证实主要以包涵体形式表达,其最佳诱导表达条件是37℃、0．5mm01／LIPTG诱导6h,表达量可接近50％;纯化的重组蛋白免疫小鼠后,间接ELISA检测抗体效价,结果该蛋白免疫BALB／c小鼠效价达10^5．[结论]TLR7胞外区该片断重组蛋白具有很好的抗原性,可以作为单克隆抗体研制的免疫原。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]对猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）的GPS蛋白进行纯化与免疫活性分析,为建立相应的血清学诊断方法奠定基础。[方法]用构建好的重组表达质粒pGEX-6P-5转化B121后经IPTG诱导表达。对表达产物进行可溶性分析,再将重组目的蛋白纯化后进行SDS—PAGE鉴定和Western—blot分析,最后用重组抗原进行豚鼠免疫试验。[结果]经层析扫描分析目的蛋白含量占菌体蛋白总量30％左右,纯化后目的蛋白纯度可迭80％。经Western—blot及豚鼠免疫试验对纯化蛋白进行分析后证明,表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。[结论]该研究为深入研究PRRSVORFs基因及其编码蛋白功能提供了材料,同时也为生产猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程产品奠定了良好基础。 相似文献
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采用RT-PCR方法从猪肾脏皮质组织中扩增出pEGF基因，将其连接到克隆载体pMD18-T上，经测序鉴定正确后，再克隆到原核表达载体pET-41a（＋）上，构建重组表达质粒pET-EGF．用重组质粒转化Ecoli BL21（DE3）宿主菌，经IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE电泳和Western-blotting对GST—EGF融合蛋白进行分析，结果表明37℃诱导表达的融合蛋白含量较高，占菌体总蛋白的20．2％；30℃诱导表达的可溶性融合蛋白含量较高，占菌体总蛋白的7．7％． 相似文献
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[目的]为猪接触传染性胸膜肺炎的诊断和基因工程疫苗的研制提供理论依据。[方法]以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清10型菌株为材料,采用PCR技术对其ApxIA的N端基因进行扩增,将扩增产物转入克隆载体和表达载体中进行克隆和表达,用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用免疫印迹分析鉴定ApxIAN端基因表达产物的免疫活性。[结果]ApxIA N端基因PCR扩增产物与标准10型ApxIAgene（D16582）的同源性为99.7%。NcoI和HindⅢ双酶切鉴定结果表明,目的基因已成功转入原核表达载体pET-32a中。含重组质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后表达了相对分子量为779 kDa的目的蛋白,该蛋白分子量与标准ApxIA蛋白（Marker）相同。[结论]SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测结果表明,ApxIAN端基因在表达载体中得到高效表达,且表达产物具有免疫活性。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株N基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株核衣壳蛋白(N)基因,然后将重组到pMD18-T载体中的约1174 bp的基因片段亚克隆到PET-32a( )表达载体上,通过酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒命名为PET-N,核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,将阳性重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约66 kD的融合蛋白,N基因的表达可为传染性胃肠炎病毒的诊断提供良好的物质材料。 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因的克隆、表达及应用 总被引：3，自引：0，他引：3
核衣壳蛋白(N)是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的重要结构蛋白。根据已报道的IBV基因序列扩增IBVN基因,割胶回收扩增产物并将其克隆到pET-28a( )载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的蛋白得到高效表达。分离纯化重组N蛋白并用其作为抗原建立ELISA检测抗体方法,研究了IBVM41攻毒后雏鸡血清特异性抗体消涨规律。 相似文献
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犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其表达产物抗原性鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
参考GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA,经RT—PCR扩增得到1572bp的基因片段,将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVN重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5a中,进行鉴定、测序。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVN重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸,与GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列相比同源率达到93．9％～99．1％。Western-blotting分析显示表达产物为84kDa的融合蛋白,可被犬瘟热抗血清所识别,具有良好的抗原性。 相似文献
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为获得具有抗原性的口蹄疫病毒(FMDV)3D蛋白N端T细胞表位的重组表达蛋白,根据FMDV3D蛋白前115位氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET-28a中,构建原核表达质粒pET28a-115,并将重组质粒转化至BL21(DE3)细胞。经IPTG诱导后,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-bolt鉴定,结果显示,在16kD处有一条明显的蛋白表达条带。对表达产物进行可溶性分析,结果表达蛋白50%为可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后获得了较高浓度和纯度的目的蛋白。研究结果表明,含FMDV 3D蛋白前115位氨基酸的重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,并具有较好的抗原活性,为开发口蹄疫诊断试剂和基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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采用RT-PCR方法扩增出狂犬病病毒(RV)CVS株核蛋白(N)基因,并将目的基因亚克隆入原表达载体pET-28 a(+)中,经PCR、双酶切以及序列分析,结果表明:已成功构建了重组质粒.将重组质粒转化至大肠埃希氏菌Rossetta(DE3),在37℃,1 mmol/L IPTG条件下进行诱导表达.诱导产物经SDS-PAGE分析,在分子量约为54 KD附近出现较粗的目的带,与预期的目的蛋白分子量相符合.经表达条件优化,用1 mmol/LIPTG在37℃诱导表达5 h,表达量达到最高,Western-Blotting鉴定目的蛋白有较强的免疫原性.为狂犬病毒的N蛋白的新型疫苗的制备奠定了基础. 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫MIC4-N的真核表达 总被引：2，自引：1，他引：1
应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫的MIC4-N端基因并去掉信号肽,为了表达检测和纯化的方便,设计引物时改变了3＇端的终止密码子,使MIC4-N的C末端带有c-myc和6His抗原标签。通过双酶切,使加工好的MIC4-N基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,转化JM109感受态细胞。再经EcoRⅠ与NotⅠ双酶切、菌落PCR及测序鉴定,证明目的基因与真核表达载体pPICZαA构建成功,单酶切重组表达载体、电转转入GS115酵母感受态细胞中。用含高浓度Zeocin的YPD平板筛选酵母菌落,菌落PCR法鉴定转化成功的阳性菌,在BMMY培养基中摇瓶培养,并用甲醇诱导,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定,蛋白分泌表达成功。 相似文献
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【目的】对H9N2亚型猪流感病毒NS1（nonstructural protein 1）基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的 ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增了猪流感病毒（H9N2）的NS1基因,将其克隆于表达载体pET-28a（+）上构建成重组质粒pET-NS1,转化受体菌E.coli BL21-DE3感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出正确重组质粒转化子。【结果】经终浓度5 mmol•L-1乳糖诱导,SDS－PAGE电泳结果显示,重组蛋白NS1得到大量表达,分子质量约为26kD。经Western-blotting分析,表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应;ELISA检测显示,在被检血清稀释1 280倍时,阳性血清的OD650值大约是阴性血清的3倍,差异明显。【结论】重组蛋白NS1表达量高,易于纯化并且具有良好的血清学反应的特异性。 相似文献
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采用生物信息学方法分析粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白的生物学特性,利用PCR方法扩增粟酒裂殖酵母yAS56菌株SpTrz2的全长和N-末端一半的编码基因,通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点将SpTrz2的全长和N-末端一半编码基因定向插入pET-28a(+)原核表达载体中,并转化大肠埃希菌BL21(DE3);经过IPTG诱导... 相似文献
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利用哺乳动物细胞表达系统对禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白进行表达,并检测所表达融合蛋白的抗原性。首先将N基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组真核表达载体,然后将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,通过倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜检测N蛋白的表达,并用Western blot检测表达蛋白的抗原性。结果显示,禽偏肺病毒核衣壳N蛋白主要表达在细胞浆中,在转染后48h后表达量最高;与抗N蛋白抗体有抗原性,所表达核衣壳N融合蛋白大小为72kDa左右,与预期结果一致。结论,本试验成功应用哺乳动物表达系统表达了禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白,表达蛋白具有抗原性,为与禽偏肺病毒核衣壳N蛋白的相关研究奠定了基础。 相似文献