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1.
猪Ⅱ型圆环病毒ORF2截短基因的表达纯化及动物免疫试验 总被引：1，自引：0，他引：1
在最佳诱导条件下获得猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）重组Cap蛋白,表达产物经可溶性分析表明该重组蛋白主要以包涵体形式存在。大量诱导表达重组Cap蛋白,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,通过Western blotting检测证明表达产物具有良好的免疫原性。用该纯化的重组蛋白作为亚单位疫苗,与本实验室所构建保存的pcDNA3.1-ORF2分别免疫BALB/c小鼠,对亚单位疫苗和基因疫苗做了对比试验,为进一步研制PCV2基因工程苗奠定良好的基础。 相似文献
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建立高表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,鉴定蛋白的免疫原性,为开发新型且有效防治猪圆环病毒的亚单位疫苗奠定基础。构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,细胞悬浮驯化及Western blot检测得到高表达Cap蛋白的悬浮稳转单克隆细胞株,并对该细胞株进行发酵,纯化得到的目的蛋白,通过小鼠免疫验证其免疫原性。结果表明PCV2-Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中正确表达;发酵过程中活细胞密度高达6×10~6个·mL-1,细胞活力在80%以上,PCV2-Cap蛋白表达量约为370 mg·L-1;利用间接ELISA检测小鼠免疫后血清中的抗体水平,证明了利用CHO-K1细胞生产的Cap蛋白具备良好的免疫原性。本研究成功构建了表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,并进一步对目的蛋白进行免疫原性分析,为猪圆环病毒亚单位疫苗的开发打下扎实的基础。 相似文献
3.
为筛选出制备猫瘟热亚单位疫苗的最佳佐剂类型与首选抗原片段,本试验对虎源FPV-HLJ株VP2全长基因及其截短基因片段PAB进行原核表达,切胶法纯化的表达蛋白经Western blot分析后,分别与氢氧化铝胶佐剂及弗氏佐剂混合,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA方法检测小鼠体液免疫水平,初步评价各疫苗的免疫效果。结果表明:VP2、PAB融合蛋白主要以包涵体形式表达,切胶法获得的高纯度表达蛋白均能与鼠抗虎源FPV阳性血清发生特异性反应。纯化蛋白各佐剂免疫组免疫小鼠后均引起较强的特异性抗体IgG反应,其中PAB蛋白各免疫佐剂组抗体水平明显高于VP2蛋白相应免疫佐剂组,且PAB蛋白+氢氧化铝胶组与PAB蛋白+弗氏佐剂组抗体水平无显著差异(P0.05),但与未加佐剂组差异显著(P0.01)。研究证实,PAB蛋白具有良好的免疫原性,可与氢氧化铝胶佐剂协同用于FPV亚单位疫苗的制备。 相似文献
4.
为获取猪圆环病毒3型衣壳蛋白(PCV3-Cap蛋白),本试验参照PCV3 HBBD1810毒株(GenBank登录号：MK105924)的基因组序列信息合成cap基因，并将其克隆至原核表达载体pET-32a中，对重组质粒进行测序和双酶切鉴定后，将重组质粒转化Rosetta大肠杆菌，对最佳IPTG诱导浓度和诱导表达时间筛选，并对目的蛋白表达后的存在形式进行检测以及对纯化条件进行筛选，透析复性后利用鼠源抗PCV3-Cap单克隆抗体进行Western blot以验证目的蛋白的反应原性。结果显示，通过构建原核表达系统获得大小为42 kDa的PCV3-Cap蛋白；破菌处理后目的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中；0.2 mmol/L IPTG 37℃下诱导培养8 h后蛋白表达量较高；在300 mmol/L咪唑洗脱时纯化出清晰条带；经过Western blot验证目的蛋白能够被鼠源抗PCV3-Cap单克隆抗体识别，具有良好的反应原性。结果表明，本试验成功构建了PCV3-Cap蛋白表达载体，成功表达PCV3-Cap蛋白，同时优化了表达和纯化条件，为PCV3亚单位疫苗的研制以及检测试剂盒的开发和研究提供... 相似文献
5.
猪α干扰素对猪圆环病毒2型亚单位疫苗免疫效果的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
为了评估酵母表达的PCV2 Cap蛋白在猪体的免疫特性以及猪α干扰素对其的免疫佐剂效果,将酵母表达的PCV2 Cap蛋白配比适量的铝胶或重组猪α干扰素制成亚单位疫苗.30日龄仔猪分别接种铝胶佐剂亚单位疫苗和猪α干扰素佐剂亚单位疫苗,同时设攻毒对照与空白对照,首免后21 d加强免疫,二免后14 d用PCV2 JS株攻毒.铝胶佐剂亚单位疫苗免疫猪体后产生了PCV2特异性中和抗体.猪α干扰素佐剂亚单位疫苗组仔猪免疫后产生的ELISA抗体和中和抗体都显著高于铝胶亚单位疫苗组仔猪.攻毒对照组的4只仔猪攻毒后全都产生了病毒血症,并有较长时间的发热;铝胶亚单位疫苗组4头仔猪中只有1头仔猪产生病毒血症,添加猪α干扰素亚单位疫苗组的仔猪攻毒后都没有产生病毒血症.综合分析试验猪的病毒感染、临床表现和生产性能等情况表明Cap蛋白亚单位疫苗具有免疫保护效果,猪α干扰素可显著增强Cap蛋白亚单位疫苗接种仔猪的体液免疫反应,提高PCV-2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护效果. 相似文献
6.
为建立猪圆环病毒2型(PCV2)山西流行毒株Cap蛋白的原核可溶性表达体系,并分析比较重组蛋白与2种商品化基因工程Cap亚单位疫苗在小鼠体内不同阶段的免疫原性,本试验以PCV2e SXJX株(GenBank登录号：MH922991.1)的ORF2基因为基础,根据大肠埃希菌密码子偏性优化序列,将其插入原核表达载体pET-28a-c(+)中,鉴定为阳性后转入宿主菌BL21(DE3)中,经优化表达条件后,对超声破碎后的菌体上清进行纯化,分析纯化后产物的纯度和抗原性,并利用负染透射电镜观察重组Cap蛋白体外自组装成病毒样颗粒(VLPs)。分别将同等免疫剂量的PCV2e重组Cap蛋白和2种商品化PCV2基因工程亚单位疫苗免疫健康BALB/c雌鼠,应用ELISA方法检测不同阶段小鼠体内特异性抗体的水平。结果显示：重组Cap蛋白可在大肠埃希菌中表达,以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中,表达产物纯化效果良好,并能被PCV2单克隆抗体识别;透射电镜观察结果发现,表达的重组Cap蛋白可以自组装成约20 mm大小的VLPs;动物免疫试验结果显示,在首免后第21天PCV2e Cap试验组抗体水平显... 相似文献
7.
为获得高蛋白含量和良好免疫原性的抗原,利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达,采取正交试验设计确定三因素(High five细胞浓度、病毒感染量、蛋白表达时间)的最佳组合,对重组病毒株vBac-SP-PCV2的表达条件进行优化,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,纯化蛋白作为标准蛋白用于Western blotting中蛋白质定量分析和蛋白免疫原性检测。结果显示:2.0×10^6/mLHigh five细胞浓度、1.5MOI病毒感染量、蛋白表达时间168h为重组PCV2-rCap蛋白表达的最佳条件,表达产物纯化良好,并能被PCV2多克隆抗体识别,免疫豚鼠可诱导产生高水平PCV2抗体。研究表明纯化PCV2-rCap蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2亚单位疫苗研发候选抗原。 相似文献
8.
为获得高蛋白含量和良好免疫原性的抗原,利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达,采取正交试验设计确定三因素(High five细胞浓度、病毒感染量、蛋白表达时间)的最佳组合,对重组病毒株vBac-SP-PCV2的表达条件进行优化,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,纯化蛋白作为标准蛋白用于Western blotting中蛋白质定量分析和蛋白免疫原性检测。结果显示：2.0×106/mL High five细胞浓度、1.5 MOI病毒感染量、蛋白表达时间168 h为重组PCV2-rCap蛋白表达的最佳条件,表达产物纯化良好,并能被PCV2多克隆抗体识别,免疫豚鼠可诱导产生高水平PCV2抗体。研究表明纯化PCV2-rCap蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2亚单位疫苗研发候选抗原。 相似文献
9.
本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。 相似文献
10.
猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用 总被引：6，自引：0，他引：6
对含有已构建的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET-ORF2s的BL21菌进行诱导表达,纯化重组蛋白包涵体,Western-blot检测纯化蛋白,将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,建立可检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。用该方法对吉林省多个种猪场收集的179份血清样品进行检测,总阳性率为42.5%。由此说明,本试验建立的PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,适用于大规模猪场血清学检测。 相似文献
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The study was aimed to prepare vaccines with different adjuvants,and research its effects on immunogenicity.The PCV2 Cap gene with its signal peptide removed was connected to pET-28a vector,and then was induced to express,using sodium deoxycholate（DOC）and low concentration of urea to dissolve the inclusion body.Different adjuvants,such as alum-based adjuvants,liposome adjuvants,propolis adjuvants,white oil adjuvants and Freund adjuvant were prepared,together with protein purified to make up subunit vaccines,and commercial inactivated vaccine as positive control,immuning mice,and ELISA method were used to detect changes in concentrations of animal serum antibody and cytokines,evaluated the immune protective effect.Results showed that the expression product in the form of inclusion body,using the DOC could omit dissolving inclusion body protein renaturation steps,and the purification method was simple,the capsid protein obtained had high purity.ELISA assays showed that PCV2-Cap had good immunogenicity.And we found that the water system adjuvants had high immune activity,this could provide important previous experimental data for the commercialization of the subunit vaccine. 相似文献
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为制备猪圆环病毒2型商品化亚单位疫苗选择良好的佐剂,对由水性佐剂GEL 01、白油佐剂以及氢氧化铝胶佐剂分别制备的3种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的免疫效果进行比较研究。本实验选取3~4周龄猪圆环病毒2型抗体阴性猪30头,根据试验疫苗接种情况分为6组,分别为:3种不同佐剂制备的亚单位疫苗(A组、B组和C组)、商品化疫苗(D组)以及空白对照组和攻毒对照组,然后进行临床观察、抗体水平监测和免疫效力评价,观察各组仔猪的不良反应情况、抗体水平以及攻毒保护情况。结果显示:3种不同类型佐剂制备的猪圆环病毒2型亚单位疫苗接种猪后均无任何不良反应、能刺激机体产生良好的ELISA抗体水平和免疫效果,但水性佐剂GEL 01制备的疫苗与另外2种佐剂制备的疫苗相比,综合抗体水平、免疫效果等因素,水性佐剂GEL 01制备的疫苗在临床使用上更具优势,为商品化亚单位疫苗佐剂的选择提供了重要的数据支持。 相似文献
13.
为将猪圆环病毒2型(PCV2)的多个抗原表位串联,并在大肠杆菌中表达,本研究人工合成PCV2多抗原表位串联的编码序列并与pET32a(+)载体连接构建重组表达质粒。将其转化到BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达。检测结果显示,多抗原表位串联基因在大肠杆菌中获得表达并以包涵体形式存在;表达的融合蛋白分子量约为27 ku。将包涵体溶解并经Ni-His柱纯化得到纯化的目的蛋白,western blot和ELISA结果显示,该表达产物具有较好的反应原性。 相似文献
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疫苗佐剂是使疫苗免疫原性充分发挥的工具,目前动物疫苗佐剂主要以铝盐佐剂和油乳佐剂为主。近年来基因重组疫苗和亚单位疫苗发展迅猛,而这些新型疫苗与传统疫苗相比免疫原性较弱,这就对佐剂提出了更高的要求。当前针对佐剂的研究层出不穷,部分佐剂如MF59、AS01、AS03等已经在人用疫苗中成功应用,但应用于动物疫苗还有技术难题需要攻破。蜂胶佐剂目前在动物疫苗中应用较广,且已经占有了一定的市场份额。为充分比较现有新型疫苗佐剂的优缺点,为后续疫苗佐剂的研究提供参考,就目前广泛研究的新型动物疫苗佐剂进行综述。 相似文献
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猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究 总被引：9，自引：0，他引：9
PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3．1（＋），构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表达，命名为pCORF2BVP22和pCBVP220RF2。分4组肌肉免疫BALB/c小白鼠，分别注射pCDNA3．1（＋）、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP220RF2，共免疫2次，间隔2周，分别于首免后2周和二免后4周采血，ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达，将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP-N1载体，构建了pNORF2和pNBVP22，转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示，通过两次免疫后，各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体，同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好。本研究为防制猪2型圆环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗。 相似文献
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以猪圆环病毒2型(PCV2)遗传标记毒株为毒种,经细胞培养传代,优化了病毒增殖条件,获得较高滴度的病毒培养物用于PCV2灭活疫苗的研制。为了比较不同免疫佐剂的效果,本试验对国产矿物质白油和铝胶两种佐剂以及赛比克公司提供的MONTANIDETMISA206、ISA15VG、IMS1315VG3种佐剂配制的灭活疫苗进行了猪体免疫试验。通过临床观察、血清抗体效价测定,确认ISA15VG佐剂配制的疫苗在增强免疫效果方面优于其它佐剂。按5种佐剂免疫效果排序为ISA15VG、IMS1315VG、铝胶、ISA206、国产白油。ISA15VG佐剂属于水包油剂型,可刺激接种动物产生快速免疫应答反应,抗体产生效价高、持续时间长,有可能成为新型PCV2灭活疫苗佐剂的候选。 相似文献
17.
鞭毛蛋白FliC与外膜蛋白TolC均具有免疫保护效果,其中FliC蛋白具有疫苗佐剂的特性,但目前尚未有关迟缓爱德华菌(E.tarda)FliC-TolC融合产物免疫动物的免疫效果的相关报道。为研究E.tarda FliC-TolC融合蛋白的免疫特性,本研究利用融合PCR方法扩增获得fliC-tolC片段,构建重组载体pET-28a-fliC-tolC,并利用E.coli BL21表达系统表达了融合蛋白FliC-TolC。将纯化的FliC-TolC、TolC、FliC蛋白免疫小鼠后,以E.tarda强毒株攻毒评估免疫效果;并利用斑马鱼模型进行了平行试验。结果显示,本研究克隆了E.tarda fliC-tolC基因并表达和纯化了相应重组蛋白FliC-TolC;FliC-TolC蛋白激发小鼠产生的抗体水平优于FliC、TolC蛋白单独免疫组,表明FliC-TolC蛋白具有优良的免疫原性。攻毒试验表明FliC-TolC蛋白组小鼠对强毒株可产生较好的抵抗力,相对保护率为95%;斑马鱼攻毒试验相对保护率为60%。本研究证实了E.tarda重组蛋白FliC-TolC的免疫效力,为进一步研制E.tarda亚单位疫苗提供了参考和借鉴。 相似文献
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Porcine circovirus type 2 (PCV2), a single-stranded DNA virus, is associated with postweaning multisystemic wasting syndrome
(PMWS). ORF2 protein (capsid) of PCV2 was recently demonstrated to be a major immunogenable to induce protection in pigs with
a prime–boost protocol. In this study, the ORF2 gene of PCV2 was expressed in insect cells. The product self-assembled into
particles that were structurally and antigenically indistinguishable from regular PCV2 capsids. To evaluated the immunogenicity
of these virus-like particles, PCV2-free piglets were vaccinated with the crude lysate from recombinant baculovirus (Ac.ORF2)-infected
insect cells, at doses of 0.1 ml (106 cells), 0.5 ml (5 × 106 cells) or 1.0 ml (107 cells). The immune response was monitored by an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for PCV2 antibody and
lymphocyte proliferation assay. The ELISA results indicated that primary immune response was elicited with 0.5 ml or 1.0 ml
of crude lysate from Ac.ORF2. After boost immunization, relatively higher levels of PCV2 antibody were elicited in 0.5-ml
or 1.0-ml vaccinated groups, compared to the 0.1-ml group. In addition, higher PCV2 specific lymphocyte proliferation response
was developed in piglets vaccinated with 0.5 ml or 1.0 ml of crude lysate, especially in those vaccinated with with 1.0 ml
of crude lysate. Thus, the expressed ORF2 protein has significant potential as a subunit vaccine against PCV2 infection. 相似文献
19.
为提高外源抗原蛋白的表达水平,根据已得到的HA-LTB融合基因,通过添加双增强子CaMV35S启动子、增强子Ω序列、内质网滞留信号KDEL序列及加长poly(A)序列等表达调控元件,构建HA-LTB高效融合植物表达载体。利用农杆菌介导方法转化百脉根,获得转基因阳性植株21株,经PCR和RT-PCR检测表明HA-LTB融合基因已整合到百脉根基因组中。利用ELISA检测转基因植株,结果表明LTB免疫佐剂与HA抗原蛋白均具有免疫原性,LTB最高表达量达到0.086 μg/mg(蛋白粗提液),HA最高表达量达到0.25 μg/mg(蛋白粗提液)。通过植物表达载体的设计和构建,使禽流感血凝素在百脉根中的表达量得到了显著提高,为禽流感可饲疫苗的研制奠定了基础。 相似文献