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1.
为了构建稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的MDCK细胞系,该研究从犬外周血淋巴细胞中克隆了犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)细胞受体SLAM基因,将鉴定正确的SLAM基因插入到高效真核表达载体pcDNA3.1(+)中.采用脂质体转染的方式将重组质粒pcDNA3.1/SLAM转染到MDCK细胞中,采用G418加压筛选及有限稀释法克隆,获取稳定表达SLAM的MDCK细胞株.结果表明,成功构建了SLAM的真核表达载体pcDNA3.1/SLAM,并通过G418筛选获得了稳定表达SLAM的细胞系MDCK. 相似文献
2.
旨在构建含有MC1R基因的pcDNA3.1(+)真核重组表达载体,为进一步研究MC1R的生物学功能奠定基础。应用RT-PCR技术从羊驼皮肤cDNA文库中扩增MC1R基因全长cDNA,然后通过双酶切将MC1R基因全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),然后采用脂质体法转染体外培养的羊驼毛囊干细胞后,通过G418筛选培养,建立稳定的转染体系,直接荧光观察pcDNA3.1/MC1R融合蛋白在细胞中的分布定位,并通过Western Blot方法检测MC1R在羊驼毛囊干细胞中的表达。结果表明,成功构建了pcDNA3.1/MC1R重组表达载体,并且发现试验组的毛囊干细胞中表达MC1R蛋白显著高于空白组(P0.05)。成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1/MC1R,且MC1R基因在羊驼毛囊干细胞中获得表达。 相似文献
3.
【目的】构建传染性喉气管炎病毒(ILTV)的真核表达载体。【方法】从传染性喉气管炎病毒河南株(ILTV-XY)感染的鸡胚绒毛尿囊膜中提取病毒DNA,进行PCR扩增,PCR产物进行T-A克隆与测序,获得了鸡IL-TV-XYgB全基因序列;对ILTV-XY株gB基因与GenBank中读取的5株ILTVgB基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行了比较分析;并将该基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,对构建的重组质粒pcDNA3.1/gB进行酶切、测序鉴定。【结果】序列测定表明,gB全基因核苷酸长度为2 629 bp,编码873个氨基酸,推导氨基酸序列有8个潜在的N-糖基化位点,有12个与二硫键形成有关的半胱氨酸。与GenBank中读取的澳大利亚SA2疫苗株、辽宁疫苗株、烟台株、美国632强毒株、英国Throne强毒株gB基因进行比较,核苷酸序列同源性为99%以上,与ILTV-SA2株gB基因比较发现,ILTV-XY株gB基因核苷酸序列在第89位均缺失1个碱基G,而在第102位又都插入1个碱基A,从而引起该毒株gB基因推导的氨基酸序列中第28~32位5个氨基酸的移码突变。构建的重组质粒pcD-NA3.1/gB经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。【结论】成功构建了ILTV的真核表达质粒pcDNA3.1/gB,为ILTV核酸疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
4.
为在真核细胞中表达牛乳头瘤病毒2型(BPV2)衣壳蛋白L1基因。采用PCR方法从奶牛皮肤肿瘤病料中扩增BPV2沙湾分离株L1基因,克隆入pMD18-T载体中,测序后进行序列分析。以pcDNA 3.1(+)为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入BHK-21细胞,通过间接荧光免疫试验检测BPV2-L1蛋白的表达。本研究成功构建pcDNA3.1(+)-BPV2-L1重组真核表达质粒,证实能表达出BPV2-L1蛋白,为BPV2DNA疫苗的研发提供了前期基础。 相似文献
5.
[目的]构建犬黑皮质素受体4（MC4R）突变体D90N真核表达载体,并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板,应用重叠PCR扩增MC4R突变体D90N目的基因,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N经酶切和测序鉴定;采用FuGENEHD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72.0h,提取细胞内总RNA,用RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,用WesternBlot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N重组真核表达载体,测序结果显示含有D90N突变位点。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N,重组体能在MD-CK细胞中表达。 相似文献
6.
[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础. 相似文献
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[目的]构建犬黑皮质素受体4真核表达载体并在COS-7细胞中进行瞬间表达。[方法]以犬MC4R线性DNA为模板,进行引物设计,PCR特异性扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)。重组体pcD-NA3.1(+)-MC4R经过酶切和测序鉴定。采用FuGENE HD介导转染技术将pcDNA3.1(+)-MC4R导入COS-7细胞,提取细胞内总RNA,RT-PCR扩增犬MC4R基因的全长cDNA编码序列。[结果]克隆犬MC4R基因的全长cDNA序列,并以pcDNA3.1(+)表达载体为骨架,构建真核表达载体,测序的扩增片段与GenBank公布的模板序列经Blast比对相似性为99%。采用G418筛选,获得带有pcDNA3.1(+)-MC4R的COS-7细胞。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1(+)-MC4R,重组体能在真核细胞中表达。 相似文献
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9.
根据已发表的猪Sar1b基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sar1b基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),获得pcDNA3.1( )-Sar1b重组载体.通过菌液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3.1( )-Sar1b构建成功. 相似文献
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嗜水气单胞菌外膜蛋白基因DNA疫苗载体的构建及分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建嗜水气单胞菌的DNA疫苗载体,根据已发表的该菌外膜蛋白基因momp的核苷酸序列设计一对特异性引物,应用PCR技术,扩增到嗜水气单胞菌L316的主要外膜蛋白基因,并插入到真核表达载体pcDNA3上,构建成DNA疫苗,命名为pcDNA3-POMP。以纯化的原核表达蛋白GST-POMP免疫SD大鼠制备抗血清,用ELISA测定抗体效价达到1∶100 000以上;用pcDNA3-POMP质粒转染293细胞,转染48h后收集细胞,提取细胞的RNA进行RT-PCR,检测到外源基因的表达。至此,初步完成嗜水气单胞菌DNA疫苗表达载体的构建,为进一步疫苗免疫和效价的检测奠定基础。 相似文献
11.
通过RT-PCR法和RACE法,分别从奥利亚罗非鱼(Oreochromisco aureus)肝脏获得alpha、rho1、rho2型GST(GSTA、GSTR1、GSTR2)基因cDNA全序列,从尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)肝脏获得GSTR1、GSTR2基因cDNA全序列。结果表明:奥利亚罗非鱼GSTA基因cDNA全序列为933bp,5′非翻译区(5′-UTR)为98bp,3′非翻译区(3′-UTR)为166bp,开放阅读框(ORF)为669bp,编码222个氨基酸。奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR1基因ORF均为681bp、均编码226个氨基酸;奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR2基因ORF均为693bp,均编码230个氨基酸。氨基酸序列同源性比较和系统进化分析均表明,罗非鱼GST基因与鱼类GST同源性较高,与哺乳类、鸟类、两栖类GST同源性较低。 相似文献
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[目的]分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Monieziaexpansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因蛋白激酶C相互作用蛋白,全长1 527 bp,编码447个氨基酸,CDS预测存在明显的BAR,PDZ结构域.编码蛋白的理论分子质量为50.173 3 ku,等电点为5.22.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础. 相似文献
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In order to provide further evidence to prove that Ascaris suum Goeze,1782 and Ascaris lumbricoides Linnaeus,1758 are really different species in taxonomy,and to identity A.suum larval migrans-related genes for diagnosis and prevention use,A.suum genes that were differentialy expressed from the same gender of A.lumbricoides were enriched by subtracting the same expressed genes using suppression subtractive hybridization （SSH） assay.Specificity of the selectively enriched cDNA was verified by Southern blot analysis.The female A.suum specific cDNA library was then constructed and sequenced.Basic local alignment search tool （BLAST） analysis of female A.suum specific cDNA identified 6 specific ESTs with tentative functions related to larva migrans.This study provided further evidence for differentiating A.suum from A.lumbricoides.Mining for the detailed information and application of the 6 ESTs are worth being done in the future studies. 相似文献
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鸡、鹅肌肉生成抑制因子基因的克隆及序列分析 总被引：5，自引：0，他引：5
采用反转录．聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从鸡胚、鹅胚中扩增得到肌肉生成抑制因子基因,分别克隆到pGEM-T Easy载体中进行序列测定．结果表明,克隆得到的MSTN基因序列均由1128个核苷酸组成,MSTN基因序列同源性为94．6％,推导相应氨基酸序列的同源性达97．9％． 相似文献
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肌肉肌球蛋白重链在生物运动过程中具有至关重要的作用,但在昆虫中此类基因极少被报道。首次克隆和分析小菜蛾肌球蛋白重链部分cDNA序列,GenBank登录号为FJ462712,其长408个碱基,推测编码135个氨基酸。同源分析表明:此多肽序列与凤蝶、家蚕、果蝇的同源性分别为95%,93%,82%。半定量RT-PCR研究表明:小菜蛾MHC基因在不同的生长发育阶段的表达皆不相同,在老熟幼虫和成虫中的表达量显著高于低龄幼虫和蛹。为进一步鉴定小菜蛾肌球蛋白重链的生理特征提供基因序列信息。 相似文献
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[Objective] To clone the porcine interleukin-18(IL-18) cDNA and explore the immunological effectiveness of porcine IL-18 as an adjuvant of genetic vaccine. [Method] The spleen lymphocytes were isolated from Henan three-way cross-breeding pigs. According to the porcine IL-18 gene in GenBank, a pair of specific primers was designed. The full length cDNA of porcine IL-18 was amplified by RT-PCR. Subsequently, porcine IL-18 cDNA was cloned into pGEM-T vector and sequenced and analyzed. [Result] The porcine IL-18 gene demonstrated an open reading frame of 579 bp encoding an inactive precursor protein with 192 amino acids. The precursor protein had no typical hydrophobic signal peptide and cleaved by interleukin-1 beta (IL-1β) converting enzyme (ICE) in caspase-1 splice site; the porcine mature protein had biological activity. After comparing with other porcine IL-18 genes, the nucleotide sequence homology was over 96% and the deduced amino acid homology was more than 98%. [Conclusion] A full length procine IL-18 gene was gained. It lays the foundation for porcine IL-18 as an adjuvant of genetic vaccine. 相似文献
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一个棉花血红素加氧酶基因的克隆及特性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
血红素加氧酶(HO)是催化血红素降解的微粒酶系统,根据HO基因的保守序列设计PCR引物,对构建棉花腺体形成时期的cDNA均一化文库PCR进行筛选,分析确定阳性克隆中cDNA片段的大小,克隆了棉花中1个HO基因全长cDNA,命名为HOCG(GenBank登记号:EU373020),并对其编码的氨基酸序列进行分析.结果显示,HOCG基因长度为1 462 bp,编码318个氨基酸,其编码的蛋白质预测的等电点和分子量分别为5 580和36 220.RT-PCR分析表明,该基因在湘棉18腺体形成前后表达有差异,该基因的克隆与分析有利于进一步探明棉花腺体形成的机制. 相似文献
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[目的]采用RT-PCR法克隆与分析瘦素受体06-Rb cDNA序列。[方法]从160日龄初情期的苏姜猪的下丘脑中提取组织总RNA．根据GenBank中猪06．RbmRNA全序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）进行cDNA扩增,获得1条343bp的片段,将PCR产物克隆于pGEM—Teasy载体后进行测序分析。[结果]用紫外分光光度计检测所提取的RNA质量,0D260／OD280=1.9,证明所提RNA的质量较好,无降解和蛋白质污染;用1％的琼脂糖检测所提RNA,有3条清晰的条带,分别是28S、18S、5S,28S与18S浓度比约为2：1．说明所提的RNA的完整性较好。所获D6-RbcDNA序列用Blast程序与在GenBank中发表的猪06-Rb cDNA序列（AF092422）比较表明,其同源性为100％,说明所扩增的序列是正确的。[结论]该研究为进一步探索Ob-Rb基因组织表达和作用机理奠定了理论基础。 相似文献