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1.
《中国兽医学报》2016,(3):407-411
为建立犬瘟热病毒(CDV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成2对通用引物和1条通用探针,通过体外转录构建绝对定量标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立CDV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达4.02拷贝/μL,比普通RT-PCR方法的灵敏度高出100倍,具有良好的重复性。对犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)核酸检测为阴性,具有很好的特异性。研究结果表明,建立的CDV荧光定量PCR方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,为犬瘟热的早期诊断提供了重要的技术支撑。 相似文献
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SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测犬瘟热病毒方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank发表的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成一对引物,建立了基于SYBR Green Ⅰ Real-time RT-PCR检测CDV核酸.以含有83 bp扩增产物的pGM-T载体质粒为参考,构建了标准曲线.对该方法的特异性、敏感性、可重复性进行了评价,与常规RT-PCR及胶体金免疫检测技术(GIA)进行了敏感性比较.结果表明,该方法能特异性检测到CDV的扩增信号;检测范围在5.2×102～5.2×108拷贝之间有良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为96.80%;敏感度高,最低检测限为52拷贝,比常规RT-PCR高103倍,比GIA高105倍;组内变异系数为0.51%～1.90%,组间变异系数为1.96%～2.63%.用建立的Real-time RT-PCR检测11例临床病例.CDV阳性率为100%.对犬瘟热弱毒活疫苗中的CDV进行定量,其含量在1.24 X105～4.88 X 105拷贝/头份之间.该方法的建立为CDV的早期快速诊断、分子流行病学调查及疫苗质量监测等提供了一种新的快速定量检测手段. 相似文献
3.
为研究猪流感病毒(SIV)感染后SIV在体内的分布规律,本研究设计针对SIV NP基因保守区引物,建立了SIV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法对SIV核酸检测灵敏度为30TCID50,对健康猪肺组织cDNA、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)核酸呈阴性反应。采用建立的荧光定量RT-PCR方法对人工感染A/swine/Shanghai/1/2007/H1N2(Sw/SH/1/2007)猪进行检测,结果显示:病毒在猪鼻腔粘膜持续存在至感染后第8d;肛门拭子在感染后2d～8d可持续检测到病毒核酸;喉头、气管在感染后第3d可检到病毒核酸,并持续至第10d;肺部淋巴结、脾脏在感染后5d～7d检测到病毒核酸阳性;其它脏器均未检测到病毒核酸,从而确定呼吸道系统及脾脏是SIV定殖的主要场所,SIV感染猪后向外排毒周期约为1周。 相似文献
4.
为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。 相似文献
5.
为建立犬瘟热病毒(CDV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据GenBank中CDVN基因保守序列设计合成了2对LAMP引物,内引物FIP、BIP和外引物F3、B3。以CDVN基因重组质粒(pMD-CDV-N)为模板,经反应条件优化、特异性试验、敏感性试验及临床样品检测。检测结果显示,该方法于61℃水浴60min即可完成反应,最低检出量为70个拷贝,比RT-PCR灵敏10倍。该检测方法仅对CDV产生阳性扩增,而对狂犬病毒,犬细小病毒,犬腺病毒Ⅱ型扩增结果均为阴性。用建立的LAMP方法检测临床样品,检测结果与RT-PCR检测结果一致。本方法简便,特异,有利于CDV的临床检测。 相似文献
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捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：1，他引：0
为建立同时检测猪捷申病毒(PTV)、猪瘟病毒(csFv)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRSV)的多重RT-PCR (mRT-PCR)检测方法,本研究以PRRSV ORF6基因、CSFV Ems基因和PTV 5＇-UTR基因为对象,建立检测3种病毒的mRT-PCR方法.特异性试验表明,该方法可以特异扩增3种病毒的基因,对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪流感病毒呈阴性反应;敏感性试验表明,PRRSV、CSFV和PTV的最低核酸检出量分别为7.11×102拷贝、7.81×103拷贝和8.43×102拷贝,略低于单一RT-PCR敏感性;应用该方法对69份送检样品进行检测,其中PRRSV、CSFV和PTV单纯感染检出率分别为28.99％、27.54％和56.52％,PRRSV和CSFV混合感染检出率为4.35％,PRRSV和PTV的混合感染检出率为11.59％,CSFV和PTV的混合感染检出率为13.04％,3种病毒的混合感染检出率为8.70％,与单一RT-PCR检测结果符合率为98.6％.本研究建立的检测方法快速简便,可以用于疾病的初步筛选,对临床早期诊断和流行病学调查具有重要意义. 相似文献
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为建立检测水貂犬瘟热病毒(mink canine distemper virus, CDV)的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量方法，以便提供水貂CDV在诊断检测方面的技术支持，本研究根据实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法原理，建立了水貂CDV数字PCR方法，并优化了反应条件，评估了特异性、敏感性以及重复性。结果表明：ddPCR方法检测CDV的最适引物浓度为900 nmol/L,探针浓度为250 nmol/L,退火温度为55℃,升降温度为2.5℃/s,最低检测下限为4.4拷贝/μL;除CDV特异性扩增，其他常见病毒特异性检测结果均为阴性；重复性试验的变异系数均小于5%。采用该微滴数字PCR和荧光定量RT-PCR方法对30份犬、貂、狐、貉等组织(其中CDV阳性样品7份)样品进行检测，检测结果与临床检测结果相符。本研究建立的微滴数字PCR方法对CDV定量检测特异性强、灵敏度高，重复性好，可以用于水貂CDV临床样品的核酸检测，对水貂CDV发病早期的诊断提供新的定量检测方法。 相似文献
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荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒方法的建立及应用 总被引：5，自引：0，他引：5
gag基因是禽白血病病毒(ALV)的群特异性基因,根据GenBank中登录的gag基因的保守序列(E46390),设计合成了1对引物,建立了基于SYBR GreenI模式的检测禽白血病病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法只对目的基因有扩增,对其它无关病毒核酸无特异性扩增;扩增效率为94.6%;在8.2×102～8.2×107拷贝的范围内有很好的线性关系(Y=3.46X+31.8,r=0.9995);最低可检测82个拷贝的病毒核酸,与普通PCR方法相比,灵敏度高出1000倍。组内CV为0.28%～1.45%;组间CV为2.13%～3.84%;对151例临床疑似样本的检出率为54.9%(83/151)。随机选择15份阳性样本PCR产物克隆测序,结果证明扩增片断为ALV的特异序列,与ALVgag基因核苷酸同源性为97.8～98.9%;对重庆14个县的14个健康商品蛋鸡群的134份粪便棉拭子进行检测,ALV的检出率为38.1%,鸡群的阳性率为14/14。同时用实时RT-PCR方法和ELISA方法对从种鸡场随机采集的30份100日龄蛋鸡的血清进行检测,实时RT-PCR检测率为5/30,ELISA方法检测率为4/30。本方法的建立为禽白血病的快速诊断、大规模检疫、监测、流行病学调查以及药物筛选等提供了新的检测方法。 相似文献
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根据犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬腺病毒2型(Canineadenovirus type2,CAV-2)GeneBank登陆的基因序列各设计一对引物,经试验条件优化,建立了检测CAV-2的PCR方法和CDV的RT-PCR方法,CAV-2可扩增1108bp片段、CDV可扩增560bp的目的片段,特异性试验表明建立的方法只能特异扩增CAV-2和CDV,不能扩增犬细小病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬钩端螺旋体和犬黄胆出血群、狂犬病病毒。敏感性试验表明,所建立的双重PCR方法可以扩增4.63ng总核酸量。在上述试验基础上继续优化条件建立了能同时检测CAV-2和CDV两种病毒的双重PCR检测方法,并用该方法检测来自辽宁、吉林等15家动物医院134份鼻液和眼眵样品,与商品化试纸条检测结果相比,本方法更加敏感和方便。研究结果表明,本实验建立的方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热病毒和犬腺病毒2型的快速检测和鉴别诊断。 相似文献
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Comparison of one-step RT-PCR and a nested PCR for the detection of canine distemper virus in clinical samples 总被引：3，自引：0，他引：3
Shin YJ Cho KO Cho HS Kang SK Kim HJ Kim YH Park HS Park NY 《Australian veterinary journal》2004,82(1-2):83-86
OBJECTIVE: To develop a rapid and sensitive method for the detection of canine distemper virus (CDV) by nested PCR using clinical specimens. DESIGN: A nested PCR was developed, compared to a one-step RT-PCR and validated. PROCEDURE: Two sets of specific primers for a one-step RT-PCR and a nested PCR, targeting a 640 bp fragment and a 297 bp fragment, respectively, were selected from the highly conserved region of the nucleocapsid protein (NP) gene of CDV. The nested PCR and the one-step RT-PCR were used to amplify a part of the CDV NP gene of a CDV vaccinal strain and samples of urine, blood, nasal discharge and saliva from 29 dogs suspected of suffering CD. RESULTS: Both the one-step RT-PCR and the nested PCR reacted with the CDV vaccinal strain, but not with canine parvovirus. The expected 640 bp fragment of the NP gene was detected in 11/22 (50.0%) blood, 10/20 (50.0%) urine, 5/25 (20.0%) saliva and 6/27 (22.2%) nasal swab samples by one-step RT-PCR, whereas the nested PCR amplified an expected 297 bp fragment of the NP gene in 18/22 (81.8%) blood, 15/20 (75.0%) urine, 14/25 (56%) saliva and 19/27 (70.3%) nasal swab samples. CONCLUSION: The nested PCR detected CDV in blood, urine, nasal swab and saliva more frequently than did the one-step RT-PCR. Therefore, this assay should be a useful aid to antemortem diagnosis of CDV infections in dogs. 相似文献
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帕利亚姆血清群病毒(PALV)在我国广泛流行,给我国牛羊养殖业健康发展构成了严重威胁,目前国内尚无PALV核酸检测方法的报道。本研究根据流行于我国的中山病毒(CHUV)、Bunyip Creek virus(BCV)和D’Aguilar virus(DAV)3种血清型PALV的Seg-7保守基因序列,设计针对PALV的群特异性RT-PCR扩增引物,通过反应条件优化,建立了PALV的一步法RT-PCR检测方法,其最佳引物浓度为0.8μmol/L;最佳退火温度为56℃。对该方法进行特异性试验,结果显示该方法可特异性的检测出CHUV、BCV和DAV核酸,而对环状病毒属的蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、非洲马瘟病毒和广西环状病毒的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对RNA标准品的最低检测限为6.9×10~1拷贝/μL。利用该方法检测血液样品,结果显示该方法检测结果与病毒分离结果基本一致。本研究建立的PALV一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感度高等优点,为开展PALV感染疫病诊断与流行病学研究提供了技术保障。 相似文献
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鸭黄病毒感染逆转录半套式PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
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为建立同时检测基因A型和C型鸭甲肝病毒(DHAV-A,DHAV-C)的双重RT-PCR方法,本实验根据GenBank中DHAV-A和DHAV-C全基因组序列,针对DHAV-A的3C、3D和DHAV-C的2C区域分别设计了2对引物,通过对反应体系和反应条件的优化及特异性、灵敏度评价,建立了检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法.该方法能够分别从DHAV-A、DHAV-C阳性样本中扩增出DHAV-A (259 bp)和DHAV-C (194 bp)的特异片段,而不与其它被检的无关病原发生非特异反应;对DHAV-A和DHAV-C的最低检出限分别为4.98×104拷贝/μL、1.68×104拷贝/μL;对2009年8月至2011年7月送检病料检出DHAV-A和DHAV-C的阳性率分别为20％(14/70)、70％(49/70);随机抽取的DHAV-CPCR阳性样本的病毒分离结果与双重RT-PCR检测结果的符合率为100％(16/16).本研究结果显示,建立的双重RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于临床DHAV的快速鉴别诊断. 相似文献
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2014~2015年,美国、巴西等国爆发了一种症状类似于口蹄疫的水泡性疾病,病原被确定为塞尼卡病毒A(Senecavirus A,SVA)。为了鉴别和诊断塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV),本研究针对塞尼卡病毒的VP1基因和口蹄疫的5’UTR基因,合成特异性引物,优化了反应体系和扩增条件,建立了一种可同时检测塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒的双重RT-PCR方法。特异性和敏感性试验结果表明,建立的双重RT-PCR检测方法特异性好,敏感性强,对塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒最低检出量分别为104 copies/μL、103 copies/μL。本研究建立的方法对临床快速鉴别塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒感染具有重要意义。 相似文献
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ZHAO Xueli LIU Yi BAN Fuguo YAN Ruoqian WANG Huajun WANG Shujuan MA Zhenyuan WANG Dongfang 《中国畜牧兽医》2018,45(8):2086-2094
This study was aimed to establish a double TaqMan MGB Real-time PCR assay to simultaneously and specifically detect canine distemper virus (CDV) and canine parvovirus (CPV) in one reaction.Two pairs of specific primers for CDV and CPV,along with two TaqMan MGB probes for each virus were designed in the assay basing on CDV H gene and CPV VP2 gene sequences.The specificity,sensitivity and repetition of the double TaqMan MGB Real-time PCR assay were tested,and 48 samples taken from clinic suspicious CDV and CPV infected canines had been testified by the established double TaqMan MGB Real-time PCR.The results indicated that the doulde TaqMan MGB Real-time PCR assay was successfully established,and the number of standard curve correlation (R2) of CDV and CPV were 0.997 and 0.993,respectively.The specificity of the double TaqMan MGB Real-time PCR assay revealed that amplifications were showed on CDV and CPV samples,but other pathogens and negative controls had no amplifications;The sensitivity of CDV and CPV were both 10 copies/μL.Meanwhile,14 CDV positive samples,19 CPV positive samples and 4 CDV/CPV double positive samples were detected,which were consistent with the results of the sequencing.Therefore,the established double TaqMan MGB Real-time PCR assay had high sensitivity,specificity and flux accurate quantitative,which could be applied to clinical CDV/CPV infection each periods. 相似文献
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为建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)允许细胞表面的Sn和CD163受体的方法,本研究设计针对Sn和CD163基因的特异性引物和荧光探针,建立了检测PRRSV Sn和CD163受体的荧光定量RT-PCR方法.结果显示,该方法在检测101 copies/μL～108 copies/μL模板范围内具有良好的线性关系.标准曲线的相关系数r值均大于0.996,扩增效率分别为100％和107％;该检测方法对Sn和CD163的检测下限均为10拷贝,敏感性高;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于5％,具有良好的重复性.利用该方法对PRRSV感染肺泡巨噬细胞(PAM) 72 h后Sn和CD163受体mRNA的转录水平进行了检测,结果表明Sn和CD163受体的转录 水平显著上调.本研究为PRRSV病毒感染后两种主要受体变化趋势的研究提供了有效的检测方法. 相似文献