表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建   总被引：1，自引：1，他引：0  

孙莹  张兵  李岭  黄小洁  侯力丹  刘丹  李启红  李俊平  王乐元  李慧姣  杨承槐 《中国农业科学》2019,52(23):4398-4405

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。  相似文献   

表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建   总被引：2，自引：2，他引：0  

孙莹  李俊平  黄小洁  李岭  曹明慧  李启红  李慧姣  杨承槐 《中国农业科学》2016,49(14):2805-2812

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa^[1]。将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF（moi=0.01）,每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221）,观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196-723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为10^6.2TCID₅₀/0.1mL、10^5.5TCID₅₀/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1-5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15-20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以10^3.0TCID₅₀/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性,为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。  相似文献   

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子   总被引：1，自引：0，他引：1  

陈柳  倪征  余斌  华炯钢  叶伟成  云涛  刘可姝  朱寅初  张存 《中国农业科学》2020,53(24):5125-5134

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。  相似文献   

基于PK15细胞的猪圆环病毒2型全悬浮培养工艺     

王嘉琪  董育红  姜菊玲  钱建宁  魏文涛  宋国亮  焦金波  关新新  姬郭彪  张业炘 《中国农业科学》2021,54(6):1280-1287

【目的】筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株,摸索PCV2悬浮生产工艺（病毒种毒来源、MOI及收获时间）,为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据。【方法】使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板,每2 d观察细胞生长和形态,待细胞90%长满后,将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板,最后到方瓶,筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆。3株克隆（PK15-1C8、2F11、1E5）按照1×10⁶细胞/mL的密度,直接接种在PK15的无血清培养基中,并置于37℃,5%二氧化碳,120 r/min的摇床培养箱中继续培养,每天监测细胞密度和活率,每3 d传代,使细胞逐渐适应悬浮环境,驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株;细胞传代稳定并建库后,接种PCV2病毒,通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异,筛选1株克隆细胞,用于生产PCV2;针对不同种毒（来源于贴壁细胞或悬浮细胞）,摸索感染MOI（0.1、0.2、0.5）及收获时间（48、72、96、120h）,确定PCV2最佳生产工艺。【结果】（1）贴壁细胞置于无血清培养基中,适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长,连续传至11代,细胞生长稳定,按照1×10⁶/mL接种细胞,细胞生长72h时细胞密度可达到10×10⁶/mL,活率在95%以上,倍增时间为20h左右;（2）3株悬浮细胞使用相同条件,分别接种PCV2病毒后,PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到10^6.4TCID₅₀/mL,克隆PK15-2F11（10^5.5TCID₅₀/mL）、PK15-1E5（10^5.6TCID₅₀/mL）,3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆（10^4.7TCID₅₀/mL）,但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定,确定为后续研究用细胞;（3）使用贴壁细胞来源的种毒（10^6.4TCID₅₀/mL）感染PK15-1C8克隆细胞后,最优工艺为接毒时细胞密度1×10⁶/mL,以0.1MOI接毒,接毒后72h收获,最高病毒含量为10^6.5TCID₅₀/mL。以来源于悬浮细胞的种毒（10^6.3TCID₅₀/mL）感染细胞后,病毒含量较贴壁细胞来源种毒更高,最高可达10^7.3TCID₅₀/mL,其最优工艺为接毒时细胞密度1×10⁶/mL,以0.2MOI接毒,接毒后72h收获。【结论】通过对PK15细胞进行单克隆筛选,驯化悬浮、3株悬浮细胞接种PCV2后病毒含量的对比,确定一株病毒含量最高的悬浮细胞,并以此悬浮细胞为基础进行PCV2生产工艺摸索,建立了全悬浮无血清培养的PK15-1C8细胞增殖PCV2工艺,该工艺首次使用悬浮细胞扩增PCV2病毒为种毒进行接毒,最高病毒含量可达10^7.3TCID₅₀/mL,可用于工厂化疫苗生产。  相似文献   

MDV CVI988/Rispens弱毒株VP22基因克隆和序列分析   总被引：3，自引：1，他引：3  

陈鸿军  秦爱建  丁铲  苗晋锋  张鑫宇  何秀苗  金文杰  刘岳龙 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2003,24(4):5-8

血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的UL49h基因编码病毒被膜蛋白VP22在病毒的复制和传播过程中具有非常重要的作用.根据已发表的MDV-1 GA株的序列,从CVI988/Rispens弱毒株感染的鸭胚成纤维细胞中扩增VP22基因片段,结果获得大小为732 bp的PCR产物.将PCR产物克隆T载体并测序分析,结果发现,与经典强毒GA株相比,弱毒株CVI988的VP22存在3个定点突变和一个缺失性突变.缺失的位点亲水性强,并位于VP22主要的抗原决定簇区.结果证明强毒株与弱毒株的VP22存在明显差异,为利用CVI988 VP22的蛋白传导域传导目的蛋白奠定了理论基础.  相似文献   

鸭源NF-κB1基因荧光定量PCR方法建立及其初步应用     

张飘  贺欣薇  杨霞  曾茂芹  刘妍罕  张扬子  杨颖  温贵兰  程振涛  文明 《浙江农业学报》2021,33(2):215

为建立鸭NF-κB1(nuclear factor-kappa B, NF-κB)基因的荧光定量PCR检测方法,并以建立的方法检测鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblasts , DEF)在感染鸭肠炎病毒(DEV)后NF-κB1基因随时间变化转录表达量的变化情况。根据GenBank 上NF-κB1基因保守序列设计特异性引物,以鸭胚成纤维细胞 mRNA提取样本反转录为cDNA,进行NF-κB1基因克隆质粒构建,以此为模板建立鸭NF-κB1基因荧光定量PCR检测方法并进行特异性、重复性和敏感性试验,并利用建立的方法DEF感染DEV后NF-κB1基因随时间变化的转录变化进行检测。结果显示:建立的鸭NF-κB1基因荧光定量PCR方法标准曲线呈现典型的S型,方程为y=-3.12x+44.086(R²=1),扩增效率为109.2%;其熔解温度Tm值为(83.5±0)℃,曲线呈特异性单峰,批内变异系数小于0.3%,批间变异系数小于0.2%;检测灵敏度可达到1.79个拷贝。DEF细胞在感染DEV后NF-κB1基因随时间改变转录水平变化无规律,但整体表达水平高于正常细胞,差异显著(P<0.05),36~84 h NF-κB1基因的转录水平与正常细胞中差异极显著(P<0.01)。本研究成功建立了鸭NF-κB1基因荧光定量PCR检测方法,并对DEF细胞感染DEV后NF-κB1基因的转录水平进行了研究,为后续实验研究提供了技术和数据支撑。  相似文献   

含LoxP位点和EGFP的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体的构建     

潘华奇  刘磊  曹瑞兵  魏凡华  袁立科  李娟  孙海亮  潘光炎 《甘肃农业大学学报》2008,43(2):8-12

  相似文献   

鸭瘟病毒强弱毒株TK基因的克隆及序列比较分析     

张馨月  张存  冉多良 《新疆农业大学学报》2007,30(4):29-33

根据GenBank中已发表的鸭瘟病毒TK基因序列,设计一对引物,对1株鸭瘟病毒强毒和1株鸭瘟病毒疫苗毒进行PCR扩增。将扩增的目的片段分别克隆到pMD18-T载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,获得阳性重组质粒,然后对阳性重组质粒进行序列测定及分析。结果表明,本实验所扩增的鸭瘟病毒TK基因及侧翼UL24基因大小为1 995 bp,鸭瘟强、弱毒株TK基因及侧翼UL24基因序列完全相同,该病毒TK基因与鸭瘟病毒其它毒株AY911509与AY963569,四川株DQ640611,AV1221株EF173464,sd-01株EF417996同源性分别为99.5%,99.9%,100%,99.9%,100%,而该病毒UL24基因与鸭瘟病毒其它毒株AY911511,DQ227739,EF417996同源性为99.9%,99.8%,99.9%,表明鸭瘟病毒强弱毒株TK基因及侧翼UL24基因高度保守。为构建鸭瘟病毒TK基因缺失的转移载体奠定了基础。  相似文献   

表达小鹅瘟病毒VP2蛋白重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性   总被引：2，自引：1，他引：1  

陈柳  余斌  倪征  华炯钢  叶伟成  云涛  张存 《中国农业科学》2016,49(14):2813-2821

【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病,鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据2012年国际病毒分类委员会（ICTV）的报告,DEV被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究,而近几年也有关于鸭瘟病毒（DEV）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段,本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上,构建表达小鹅瘟病毒（GPV）主要免疫原蛋白VP2的重组病毒rDEV-VP2,并研究其生物学特性,进而探讨重组病毒rDEV-VP2作为防治DEV和GPV的二联重组活载体疫苗的可能性。【方法】将密码子优化的GPV VP2基因通过常规基因克隆的方法插入转移载体pEP-BGH-end,构建含有GPV VP2表达框pCMV-VP2-BGH-pA的重组表达质粒。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,通过“Red E/T”两步重组法将GPV VP2基因表达框插入到DEV US7和US8基因之间构建了突变体克隆pDEV-VP2。利用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得重组病毒rDEV-VP2和删除Bac质粒序列的rDEV-VP2-Cre,并对重组病毒细胞体外生长曲线、蚀斑大小和VP2蛋白表达情况进行测定。将rDEV-VP2接种番鸭,在不同时间采集血清,采用间接ELISA法检测血清中GPV VP2抗体产生情况。【结果】间接免疫荧光检测和Western blotting分析表明,外源蛋白VP2在CEFs细胞成功表达。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果显示,rDEV-VP2在CEFs细胞上的增殖滴度与亲本株相比无显著差异,表明外源基因VP2的插入不影响rDEV重组病毒的增殖。动物试验结果表明,7日龄雏番鸭接种rDEV-VP2可以诱导产生针对GPV VP2的抗体,免疫后3周抗体阳性率为50%（4/8）。【结论】本实验将小鹅瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因组的US7和US8基因间构建了表达该免疫原性基因的重组鸭瘟病毒细菌人工染色体,继而在鸡胚成纤维细胞（CEFs）上拯救获得了重组病毒rDEV-VP2,病毒细胞生长特性与亲本株基本一致,且能诱导鸭体产生GPV VP2特异性的抗体。该研究为研制DEV-GPV二联重组活载体疫苗奠定了基础。  相似文献   

猪链球菌4型转录调控因子GalR的生物学特性     

孙珂  祝昊丹  何孔旺  王丹丹  周俊明  俞正玉  吕立新  倪艳秀 《中国农业科学》2019,52(19):3485-3494

【目的】 研究分析猪链球菌4型（Streptococcus suis serotype 4,SS4）强毒株SH1510 转录调控因子GalR基因的缺失对细菌生物学特性的影响,为进一步研究GalR对半乳糖代谢途径的调控及其致病机理提供理论依据。【方法】 利用同源重组双交换的方法构建了SS4强毒株SH1510 转录调控因子GalR基因缺失株SH1510ΔGalR,通过GalR基因内部扩增引物I1/I2进行缺失株初步筛选,进一步通过PCR和Western blotting鉴定缺失株SH1510ΔGalR。对亲本株SH1510和缺失株SH1510ΔGalR进行革兰氏染色以比较形态差异;配置基础培养基,分别加入葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖后培养细菌,绘制细菌生长曲线,比较细菌对不同糖的利用率;将亲本株和缺失株的菌液浓度分别调整为2.5×10 ⁹、5×10 ⁸、1×10 ⁸、2×10 ⁷ CFU/mL,对BALB/c小鼠进行腹腔注射以观察小鼠致死率并使用Reed-Muench法计算菌株LD₅₀。将浓度为2×10 ⁷CFU/mL的亲本株和缺失株1﹕1等体积混合后腹腔注射BALB/c小鼠,24 h后取脑、脾、血在氯霉素抗性和无抗性THB平板上进行细菌计数,比较细菌在小鼠体内的定植能力;并以健康猪的全血模仿体内环境,将亲本株和缺失株分别加入含有SS4抗血清的健康猪全血中,37℃孵育2 h进行平板计数,比较细菌在全血中的存活能力。【结果】 使用内部检测引物I1/I2做PCR,缺失株SH1510ΔGalR检测为阴性,进一步使用引物C1/C2、O1/C2、O2/C1、O1/O2鉴定缺失株SH1510ΔGalR,分别扩增出1 056、2 121、2 094、3 147 bp的片段,结果和预期相符。Western blotting 鉴定结果表明亲本株SH1510可与粗制GalR多抗兔血清发生特异性结合,在37 kD处出现单一条带,但缺失株SH1510ΔGalR没有条带出现。PCR和Western blotting鉴定结果均表明缺失株SH1510ΔGalR已构建成功。亲本株和缺失株经革兰氏染色,光学显微镜下观察可见亲本株和缺失株均呈链状排列,长度相似,形态无显著差异。在葡萄糖和蔗糖作为唯一糖原的生长条件下,亲本株和缺失株的生长情况相仿,而当糖原为D-半乳糖时,缺失株的生长速率和OD₆₀₀值明显低于亲本株。另外,从最高OD₆₀₀值可以看出,猪链球菌SH1510对糖的利用率为葡萄糖>蔗糖>D-半乳糖。 小鼠致病性试验中,亲本株和缺失株的LD₅₀分别为1×10 ⁸CFU和1.62×10 ⁸CFU,缺失株对小鼠的致病性下降了1.62倍。体内竞争感染试验结果显示,缺失株在小鼠的脑、脾、血液中的细菌分离数均远低于亲本株,差异极显著（P＜0.01）。全血存活试验表示,亲本株的存活率为35.2%,缺失株的存活率为27.3%,缺失株SH1510ΔGalR比亲本株SH1510在全血中的存活率显著下降（P＜0.05）。【结论】 GalR 基因可促进猪链球菌4型对半乳糖的利用,同时对SH1510的毒力有直接或间接的调控作用。  相似文献   

禽疱疹病毒活载体疫苗研究进展     

王梦阁  吴英  程安春  汪铭书  朱德康  贾仁勇  刘马峰  陈舜  赵新新  杨乔  张沙秋  黄娟  刘韵雅  张玲  于艳玲 《中国农业科技导报》2020,22(3):85-93

禽疱疹病毒主要包括α疱疹病毒亚科的鸡马立克氏病毒( Mareks disease virus, MDV)、传染性喉气管炎病毒( infectious laryngotracheitis virus, IBDV )和鸭肠炎病毒( duck enteritis virus, DEV )。作为疱疹病毒家族的成员,禽疱疹病毒基因组庞大,存在多个复制非必需区,可容纳多个外源基因的插入,是表达其他禽类病原抗原基因的理想载体。总结了禽疱疹病毒的构建方法、外源基因表达水平,并对MDV、IBDV和DEV 三种禽疱疹病毒的不同重组病毒疫苗免疫效果评价进行归纳,旨在为畜禽传染病防治提供参考依据。  相似文献   

欧亚类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的表达及免疫原性评估     

贾云慧  许程志  隋金钰  吴运谱  许榜丰  陈艳  杨焕良  乔传玲  陈化兰 《中国农业科学》2019,52(5):930-938

鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备     

吴双  马丽丽  朱善元  陆辉 《河南农业科学》2016,(3)

为制备鼠抗鸭瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出UL6基因,连接原核表达载体p ET-32a(+),构建表达质粒p ET-UL6,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况,将目的蛋白免疫Balb/c小鼠,利用ELISA方法检测特异性抗体效价。结果显示,构建的原核表达质粒经IPTG诱导能正确表达,且表达的重组蛋白能与DPV阳性血清反应,制备的多克隆抗体效价可达1∶16 000。表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性,可以用于UL6基因的表达检测。  相似文献   

鸭肠炎病毒UL53截段基因的序列特性、原核表达与其抗原性检测#br#     

张顺川  向骏  程安春  汪铭书  李丽娟  李鑫 《中国农业科学》2010,43(21):4521-4528

【目的】通过选取DEV-UL53基因主要抗原域与进行DEV-UL53截段基因B细胞表位多参数预测相结合的策略,高效表达DEV-UL53截段基因,并通过Western blot分析重组蛋白的免疫原性。【方法】通过生物信息学软件DNAStar Protean模块对UL53基因编码的gK蛋白进行主要抗原域预测,选取主要抗原域对应的UL53截段基因进行二级结构、蛋白质骨架柔性区域、表面可及性区域预测和在线预测该蛋白的亲水性及跨膜区,并对UL53截段基因进行克隆、亚克隆、原核表达与抗原性分析。【结果】UL53截段基因编码蛋白gK的B细胞表位最可能分布于Ala20-Leu25、Ser40-Met47、Leu68-Ile78、Val124-Phe128、Ile129-Tyr134、Asp176-Ile178,构建的阳性表达质粒转入BL21表达宿主菌经IPTG诱导外源基因获得了良好表达,经Western blot分析表明该重组蛋白具有良好的抗原性。【结论】实现了UL53截段基因的高效表达,经Western blot分析表明该重组蛋白具备良好的免疫原性,这为DEV-UL53基因及其编码的蛋白gK功能的深入研究、新型疫苗和诊断试剂的研制及开发等提供可用的试验材料。  相似文献   

鸭肠炎病毒UL53截段基因的序列特性、原核表达与其抗原性检测     

张顺川  向骏  程安春  汪铭书  李丽娟  李鑫 《中国农业科学》2010,43(21)

【目的】通过选取DEV-UL53基因主要抗原域与进行DEV-UL53截段基因B细胞表位多参数预测相结合的策略,高效表达DEV-UL53截段基因,并通过Westernblot分析重组蛋白的免疫原性。【方法】通过生物信息学软件DNAStarProtean模块对UL53基因编码的gK蛋白进行主要抗原域预测,选取主要抗原域对应的UL53截段基因进行二级结构、蛋白质骨架柔性区域、表面可及性区域预测和在线预测该蛋白的亲水性及跨膜区,并对UL53截段基因进行克隆、亚克隆、原核表达与抗原性分析。【结果】UL53截段基因编码蛋白gK的B细胞表位最可能分布于Ala20—Leu25、Ser40—Met47、Leu68—Ile78、Val124—Phe128、Ile129—Tyr134、Asp176—Ile178,构建的阳性表达质粒转入BL21表达宿主菌经IPTG诱导外源基因获得了良好表达,经Westernblot分析表明该重组蛋白具有良好的抗原性。【结论】实现了UL53截段基因的高效表达,经Westernblot分析表明该重组蛋白具备良好的免疫原性,这为DEV-UL53基因及其编码的蛋白gK功能的深入研究、新型疫苗和诊断试剂的研制及开发等提供可用的试验材料。  相似文献   

鸭肠炎病毒US2基因的序列测定与分析     

李子剑  李云龙  陈苏  艾武  宋敏训  李玉峰 《山东农业科学》2008,(3):33-36

以鸭肠炎病毒(DEV)SD-01株DNA为模板,根据GenBank上已发表的基因序列设计一对引物,利用PCR技术扩增出US2全基因,将目的条带连入pGM-T载体,得到的阳性重组质粒命名为pGM-US2并进行序列测定。将测序结果与疫苗株、鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗(C-KCE)株和单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)、马立克氏病病毒(MDV)、伪狂犬病病毒(PRV)的US2基因同源性进行比较,发现核苷酸和氨基酸的序列同源性分别为100%~25.8%和100%~28%。结果表明,US2基因在DEV中是完全保守的,但与其它疱疹病毒相比同源性较低。  相似文献   

同时快速检测马铃薯X病毒、Y病毒和S病毒试纸条的研制     

张微  李志新  赵雪  张金鹏  付春江  刘卫平  于倩倩 《中国农业科技导报》2022,24(1):211-217

为实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯X病毒(PVX)、Y病毒(PVY)和S病毒(PVS),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,利用抗体与胶体金相结合的特性制备金原子与PVX、PVY和PVS抗体结合物(简称金标抗体),通过三维划膜喷金仪将金标抗体喷射于玻璃纤维上作为金标垫,将PVX抗体、PVY抗体和PVS抗体分...  相似文献   

鸭CD8α基因启动子的分析及其转录活性     

徐琪  陈阳  黄正洋  张扬  陈昌义  赵荣雪  李秀  段修军  陈国宏 《中国农业科学》2012,45(12):2468-2473

【目的】对鸭CD8α基因启动子活性区域进行分析,为鸭CD8α基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】利用前期基因组步移技术获得的鸭CD8α基因的启动子区序列,制备一系列启动子缺失突变体（-625/-1 bp,-1 110/-1 bp,-1 413/-1 bp,-2 151/-1 bp）,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建荧光素酶报告基因重组载体,采用 Lipofectamine 2000 将重组质粒瞬时转染DT40细胞,分析CD8α基因启动子系列缺失突变体在细胞内的转录活性。【结果】鸭CD8α基因 5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,-1110--625启动子活性最强,且-625--1和-625--1 110 bp区域均存在正调控元件。【结论】成功构建了荧光素酶报告基因真核表达载体,确定了鸭CD8α基因调控区,为进一步研究其转录调控机制奠定了基础。  相似文献   

Correlation Research of the Serological Test (HI) and Challenge Test of Duck Tembusu Virus Inactivated Vaccine   总被引：1，自引：1，他引：0  

WANG XiaoLei  LIN Jian  YANG ZhiYuan  LIU LiXin  DUAN HuiJuan  CHENG HuiMin  ZHAO JiCheng  PAN Jie  LIU YueHuan 《中国农业科学》2019,52(23):4423-4428

【Objective】The objective of this paper was to evaluate the correlation of the serological test (HI) and challenge test of duck Tembusu virus inactivated vaccine.【Method】Three batches of vaccines ( laboratory trial products) were used to immunize the 51-day-old young ducks and 260-day-old laying ducks by intramuscular injection in 0.15, 0.3, 0.5 and 1.0 mL, respectively. Secondary immunization was proceeded in the same doses and route at 14 day after primary immunization. Ducks were regrouped according to the HI titer and challenged with 0.5 mL (100 DID₅₀) DTMUV at day 28 after secondary immunization. Serum samples were collected at 2 days later for virus isolation and laying ducks were dissected at 8 days later to observe the ovarian lesions. All the results were counted to evaluate the immune potency of vaccines. The correlation of HI titer and immune protection rate was analyzed.【Result】The protection rate of immunized young ducks with HI titer of 1:5 or lower, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 was 50% (20/40), 43.8% (7/16), 74.3% (26/35), 86.7% (26/30), 96.6% (57/59), 92.7% (51/55), 95% (38/40) and 100% (11/11), respectively. The protection rate was 48.2% with HI titer lower than 1:20, while the rate was 74.3% with HI titer of 1:20 and 93.8% with HI titer of 1:40 or greater. In laying ducks, the protection rate of flocks with HI titer of 1:5 or lower, 1:20, 1:40 and 1:80 was 66.7% (12/18), 83.3% (10/12), 95.2% (20/21) and 100% (15/15), respectively. The protected proportion of ducks with HI titer of 1:10, 1:160, 1:320 and 1:640 was 2/3, 7/7, 1/1 and 2/2, respectively. The protection rate was 66.7% with HI titer of 1:10 or below, while the rate was 83.3% with HI titer of 1:20 and 97.8% with HI titer of 1:40 or greater. There were significant positive correlations between the HI titer and the immune protection rate both in young ducks and laying ducks. The Spearman’s correlation coefficient was 0.905 (P<0.01) and 0.932 (P<0.01), respectively. 【Conclusion】There were positive correlations between the HI titer and the immune protection rate of duck Tembusu virus inactivated vaccine (strain HB). The HI detection could be used to evaluate the efficacy of duck Tembusu virus inactivated vaccine (strain HB) instead of challenge test. The HI titer of 1:20 could be defined as the criteria of protection for the duck Tembusu virus inactivated vaccine after immunization.  相似文献   

鸭肠炎病毒核衣壳蛋白密码子偏爱性分析     

高颖  代淑燕  张荷  程振涛  周碧君  文明 《山地农业生物学报》2011,30(2):136-140

为给鸭肠炎病毒（DEV）核衣壳蛋白（NP）基因选择良好的宿主表达系统提供参考依据,本研究运用EM-BOSS软件包CHIPS和CUSP程序对DEVNP基因进行了密码子偏爱性分析。结果显示,DEV NP基因的ENC值为51.180,编码NP蛋白的A、I等氨基酸不同密码子的使用频率存在一定的差异;从与DEV NP基因密码子使用频率比值上看,大肠杆菌22个、酵母18个、鸭12个和人20个密码子存在较大的偏爱性。由此可见,编码DEVNP蛋白密码子出现频率较均一,且酵母等真核生物与其密码子偏爱性较为接近,可作为该基因体外表达宿主的首选。  相似文献