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1.
《养殖与饲料．饲料世界》2015,(11)
为构建表达TGEV S基因AD片段的重组乳酸杆菌,根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的抗原决定簇AD片段的基因序列,设计引物,PCR扩增该片段,测序正确后利用穿梭质粒整合进益生乳酸菌中表达。结果显示,经过酶切、PCR和PAGE电泳鉴定重组的r S-AD基因在乳酸菌中得到了表达。所以,获得了表达TGEV S基因AD片段的重组乳酸杆菌。 相似文献
2.
猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)纤突蛋白S携带主要的B淋巴细胞抗原表位,是诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的主要结构蛋白,本试验通过PCR扩增,获得TGEV S蛋白上约1 218bp的保护性抗原基因S1,将其克隆到pMD18-T载体并进行核酸序列测定。通过双酶切连接成功获得重组质粒pNZ8149-S1,电转化至乳酸乳球菌NZ3900中,经乳链菌肽诱导,SDS-PAGE和Western-Blot分析结果显示,TGEV S1基因获得了表达,表达产物具有反应原性。间接免疫荧光试验结果表明,重组乳酸菌表达的蛋白位于菌体表面。 相似文献
3.
采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S.从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基因的重组质粒pVAX-S-N.对重组质粒PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况.结果表明,重组质粒构建正确且在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光.真核表达质粒pVAX-S-N的成功构建为进一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物质基础. 相似文献
4.
为获得具有天然活性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白,制备针对猪传染性胃肠炎S蛋白A、D抗原位点的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本研究将TGEV S基因A、D抗原位点经PCR扩增并克隆入p Fast Bac HBM-TOPO载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒,并对重组杆状病毒进行间接免疫荧光(IFA)及Western blot分析,结果显示,TGEV S基因A、D抗原位点在杆状病毒中成功表达,其表达产物为TGE诊断试剂的制备、基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
5.
为了建立检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),试验参照GenBank公布的TGEV TH-98株S基因序列,设计合成1对引物,RT-PCR扩增相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-32a中,以大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞为表达菌株进行诱导表达。再以纯化重组蛋白作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等参数建立检测TGEV S蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明:试验成功克隆了TGEV S基因,扩增片段长度为4 003 bp;构建了重组表达质粒pET-S,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得高效表达,表达蛋白分子质量约为148 ku;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot分析显示,重组蛋白具有良好的抗原性;以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,建立了TGEV S蛋白抗体检测间接ELISA方法;该ELISA方法的抗原最佳包被浓度为18.85μg/mL,最适血清稀释比例为1∶40。 相似文献
6.
采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。 相似文献
7.
将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
8.
携带猪传染性胃肠炎病毒S/N融合双基因的减毒沙门氏菌的构建与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在构建携带猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S/N融合双基因的减毒沙门氏菌,并鉴定该疫苗菌株的生物学特性,为开展TGEV口服免疫研究奠定材料基础。采用PCR方法从克隆质粒19T-S和19T-N中分别扩增了TGEV的S基因(含主要抗原位点,2.1kb)和N基因(1.2kb),将S基因和N基因插入pVAX1载体,构建携带S/N融合双基因的真核表达质粒pVAX-S/N。将pVAX-S/N电转化减毒沙门氏菌SL7207,筛选获得重组菌株SL7207(pVAX-S/N),并对重组菌株SL7207(pVAX-S/N)的体外稳定性、目的基因在体内的转录、口服接种小鼠的安全性及在体内稳定性等特性进行了鉴定。结果表明,真核质粒pVAX-S/N构建成功,该质粒转染COS7中能表达2个目的蛋白,重组菌SL7207(pVAX-S/N)在Kan+抗性下体外培养稳定性好,口服接种小鼠3d可从回肠组织检测到目的基因的转录,以0.5×109、1×109和2×109 CFU口服对小鼠均具有安全性,重组菌在接种小鼠的肝、脾于4周左右逐渐被机体清除。结果表明成功构建TGEVS/N双基因疫苗SL7207(pVAX-S/N),该疫苗具有良好的稳定性与安全性等特点,为开展TGEV口服免疫研究奠定了基础。 相似文献
9.
为获得传染性胰腺坏死病毒(IPNV)VP3蛋白在菌体表面表达,本研究将IPNV VP3基因定向插入乳酸杆菌表面表达型载体pPG1,构建的重组质粒pPG1-VP3电转化干酪乳杆菌,获得了重组干酪乳杆菌表达系统pPG1-VP3/Lactobacillus casei393。经1%糖诱导表达后,SDS-PAGE和western blot检测表明,有约31ku蛋白得到了表达,其大小与理论值相符;诱导表达的菌体进行间接免疫荧光试验表明,重组蛋白在菌体表面获得了表达。该病毒VP3蛋白在乳酸菌的表面表达为进一步探讨传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白免疫原性及相关功能奠定了基础。 相似文献
10.
为构建以木糖为选择标记的乳酸杆菌表达载体,根据GenBank登录的E.coli JM109 xylA和xylB基因序列设计引物,以E.coli JM109基因组为模板,扩增xylAB基因,与人工合成的多克隆位点序列MCS基因、去除氯霉素基因的乳酸菌载体质粒pPG2片段及以pPG2载体质粒为模板扩增的repA基因连接,电击转化于L.casei 393感受态细胞,获得以木糖为选择标记的乳杆菌表达载体并命名为pOXM2。为鉴定pOXM2载体表达蛋白的效果,以含猪细小病毒VP2基因的重组质粒pMD-VP2为模板,扩增VP2基因序列,与载体质粒pOXM2连接,产物电击转化L.casei393感受态细胞,获得阳性克隆子pOXM2-VP2。重组菌经诱导,并进行SDS-PAGE及western blot分析。结果表明,有约180ku重组蛋白得到了表达,而且表达的重组蛋白具有与天然病毒蛋白一样的免疫反应特异性。本研究结果表明已成功构建了以木糖为选择标记的乳杆菌表达载体并实现了外源基因的表达,为进一步研究以重组干酪乳杆菌作为口服疫苗或表达功能性蛋白奠定了基础。 相似文献
11.
以乳酸杆菌为载体的猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原位点DNA疫苗的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
应用pRc/CMV2真核质粒骨架,先后插入猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因AD抗原位点片段和乳酸杆菌复制子基因Rep.8014,构建了pRc/CMV2-SAD-Rep.8014真核表达穿梭质粒。将其转染PK-15细胞,RT-PCR检测到S基因A D抗原位点的mRNA表达。随后,将pRc/CMV2-SAD-Rep.8014质粒电转化猪源的Lactobacillus acidophilusSW1株,成功构建了以乳酸杆菌为载体的带有TGEV S基因AD抗原位点的DNA疫苗株L.acidophilusTGES-1。本研究结合了乳酸杆菌胃肠道常在共生菌的优势和TGE呈现肠道局部发病的特点,达到益生性与免疫预防的双重功效,对乳酸杆菌口服DNA疫苗进行了有益的探索。 相似文献
12.
本试验旨在克隆植物乳杆菌(L.plantarum)DPP8的胆盐水解酶(BSH)基因,并在干酪乳杆菌(L.casei)CECT5276中对其进行表达。通过PCR技术克隆L.plantarum DPP8的BSH基因,然后将该基因重组到L.casei表达载体pMJ67-sp中,获得了重组表达质粒pMJ67-sp-BSH,再将其电转化至L.casei CECT5276中,通过乳糖诱导BSH分泌表达。采用牛磺酸标准曲线法对表达产物的BSH活力进行测定,并采用邻苯二甲醛(OPA)法对其降胆固醇能力进行测定。结果显示:本试验获得了BSH基因的全长序列,为975 bp;同源性比较显示该基因与L.plantarum MBUL69的BSH基因的同源性为99.6%;进化树分析显示该基因与L.plantarum MBUL69的BSH基因处于同一分支。表达产物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示获得了1条分子质量约为37 ku的蛋白条带,与推测的BSH蛋白分子质量大小相符。酶活力测定结果表明重组菌株在37℃、0.5%乳糖诱导36 h时,表达产物中BSH活力最高,可达42.57 U/mL。重组菌株在含2%胆固醇的MRS培养基中培养48 h后,胆固醇降解率为94.43%。综上可知,本试验成功克隆了L.plantarum DPP8 BSH基因,并实现了其在L.casei CECT5276中的高效分泌表达。 相似文献
13.
为筛选适宜乳酸菌(LAB)宿主表达载体的启动子,本研究以大肠杆菌- LAB穿梭载体pPG612为基本骨架,利用GatewayTM克隆技术操作构建了LAB组成型启动子探测载体,并利用该载体筛选了短乳杆菌的S层启动子.我们利用底物X-gluC与报告基因gusA编码的蛋白酶之间的特异性显色反应筛选阳性菌落,超声破碎后的菌体蛋白经SDS-PAGE和westem blot分析表明该启动子在宿主菌中具有组成型启动子活性.本研究为进一步利用表达载体及筛选其他LAB启动子奠定基础. 相似文献
14.
为探索干扰素诱导跨膜蛋白1（interferon-inducible transmembrane protein 1,IFITM1）对猪源冠状病毒复制的影响,本研究选用猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）高致病毒株及其宿主细胞PK15作为研究对象。正常PK15细胞接种TGEV后,实时荧光定量PCR检测感染后不同时间点PK15细胞中一些干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes,ISGs）的mRNA表达水平;利用慢病毒表达系统构建稳定表达和稳定干扰IFITM1表达的PK15细胞系。将一段靶向干扰猪源IFITM1的shRNA序列及猪源IFITM1全长,分别插入pLKO.1-EGFP-Puro载体及pLVML-Myc-MCS-IRES-Puro载体中,分别构建出pLKO.1-IFITM1shRNA-EGFP-Puro及pLVML-Myc-IFITM1-IRES-Puro重组质粒。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞后获得带有目的基因的重组慢病毒,慢病毒侵染PK15细胞后用嘌呤霉素进行筛选,获得稳定表达及稳定干扰IFITM1表达的PK15细胞系,分别命名为PK15-IFITM1及PK15-IFITM1-/-,并分别用实时荧光定量PCR、间接免疫荧光试验（IFA）及Western blotting检测IFITM1干扰效率及表达情况;TGEV接种PK15-IFITM1-/-和PK15-IFITM1,实时荧光定量PCR测定细胞中TGEV的拷贝数。结果显示,PK15细胞接种TGEV后的48 h内,一些ISGs的mRNA水平均有所上升;PK15-IFITM1-/-细胞系的干扰效率为70%,PK15-IFITM1细胞系表达成功;在PK15-IFITM1-/-细胞系中,IFITM1的mRNA水平显著下调,促进了TGEV的复制。反之,在PK15-IFITM1细胞系中,TGEV的复制受到了抑制。但IFITM1的表达或缺失却不影响TGEV对PK15的吸附作用。总之,IFITM1对TGEV有显著的抗病毒作用,IFITM1不影响TGEV对PK15细胞的早期吸附,这为后续IFITM1抗冠状病毒机制的研究奠定了基础。 相似文献
15.
Diqiu LiuXiangqing Wang Junwei GeSongmei Liu Yijing Li 《Comparative immunology, microbiology and infectious diseases》2011,34(1):73-81
The major structural protein VP2 of porcine parvovirus (PPV) was used as the model parvovirus antigen, which has been expressed in Lactobacillus casei fusing with Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) as mucosal adjuvant. The VP2-LTB DNA fragment was cloned into vector pPG611 or pPG612 to generated inducible surface-displayed and secretion expression systems based on xylose promoter, designated as rLc:pPG611-VP2-LTB (recombinant L. casei) and rLc:pPG612-VP2-LTB, respectively. Expression of the fusion protein was verified by SDS-PAGE, Western blot immunofluorescence and electron microscopy. It was observed that the level of IgG or sIgA from mice orally immunized with VP2-LTB was higher than that from mice received VP2 and negative control, which demonstrated significantly statistically different. Especially, the titer of IgG or sIgA in mice immunized with rLc:pPG612-VP2-LTB is the highest in this study. In summary, LTB as mucosal adjuvant was able to effectively facilitate induction of mucosal and systemic immunity by L. casei-expressing VP2 fusion protein. 相似文献
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猪传染性胃肠炎华毒弱毒株纤突蛋白B、C抗原位点片段基因的克隆与序列分析 总被引：8，自引：1，他引：7
猪传染性胃肠炎华毒（TGEV H）是我国分离的代表毒株,H弱毒株是我国自行培育成功的具有良好免疫原性的疫苗株。应用RT－PCR方法扩增出1．3kb的目的片段,包括S基因的编码的B、C两个主要抗原位点的片段,目的片段与pUC19质粒载体进行连续,转化,鉴定后得到阳性重组质粒,命名为pTS1,将重组质粒插入的目的基因片段进行序列分析和比较,其结果表明TGEV H株和S基因5’端B、C位点片段1190bp的核苷酸序列与国外的TGEV毒株Miller、Purdue-115、FS772／70及台湾省TFI毒株序列均具有很高的同源性,达94．72以上。推导的氨基酸序列同源性为94．70％以上。编码抗原位点C的序列与其它毒株完全一致,但在B位点发生改变,即第97个氨基酸发生改变,由Trp突变为Ser。该核苷酸该片段全长1261bp,包括起始密码子ATG及基因间的共同序列ACTAAAC。本研究首次报道了国内的TGEV分离株－H弱毒株S基因的RT－PCR扩增及其编码的B、C抗原位点片段的分子克隆及序列分析,为进一步揭示TGEV强弱毒差别的分子机制、开展新型疫苗及进行分子诊断的研究奠定了重要基础。 相似文献