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采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。 相似文献
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运用RT-PCR技术从由刀豆蛋白(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)扩增出猪白细胞介素-2受体γ链基因的完整开放阅读框(ORF),长约1 107 bp,编码由368个氨基酸残基组成的相对分子质量为41 780的蛋白多肽.荣昌猪IL-2Rγ与人、猕猴、牛、犬、鼠在氨基酸水平上的同源性分别为81.6%,80.8%,85.1%,83.2%和68.8%.运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rγ,开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因,共1 020 bp.将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)后在E.coli BL21中诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为52 000,重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占茵体总蛋白的37.6%;Western-blotting分析表明,在相对分子质量52 000处有一奈特异性的带;对γ诱导重组茵进行转录检测得到约1 020 bp的特异性片段. 相似文献
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携带猪传染性胃肠炎病毒S/N融合双基因的减毒沙门氏菌的构建与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在构建携带猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S/N融合双基因的减毒沙门氏菌,并鉴定该疫苗菌株的生物学特性,为开展TGEV口服免疫研究奠定材料基础。采用PCR方法从克隆质粒19T-S和19T-N中分别扩增了TGEV的S基因(含主要抗原位点,2.1kb)和N基因(1.2kb),将S基因和N基因插入pVAX1载体,构建携带S/N融合双基因的真核表达质粒pVAX-S/N。将pVAX-S/N电转化减毒沙门氏菌SL7207,筛选获得重组菌株SL7207(pVAX-S/N),并对重组菌株SL7207(pVAX-S/N)的体外稳定性、目的基因在体内的转录、口服接种小鼠的安全性及在体内稳定性等特性进行了鉴定。结果表明,真核质粒pVAX-S/N构建成功,该质粒转染COS7中能表达2个目的蛋白,重组菌SL7207(pVAX-S/N)在Kan+抗性下体外培养稳定性好,口服接种小鼠3d可从回肠组织检测到目的基因的转录,以0.5×109、1×109和2×109 CFU口服对小鼠均具有安全性,重组菌在接种小鼠的肝、脾于4周左右逐渐被机体清除。结果表明成功构建TGEVS/N双基因疫苗SL7207(pVAX-S/N),该疫苗具有良好的稳定性与安全性等特点,为开展TGEV口服免疫研究奠定了基础。 相似文献
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