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《中国兽医杂志》2019,(12)
根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构蛋白(NSP2)基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计合成NSP2特异性的引物和TaqMan探针,建立了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR, ddPCR)检测方法。结果显示,ddPCR最佳反应的引物和探针浓度分别为900 nM和250 nM;特异性和重复性检测结果表明,ddPCR具有良好的特异性和较高的重复性;灵敏度检测结果表明,ddPCR的检测灵敏度比荧光定量PCR高10倍;ddPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为R~2=0.999 1,表明该方法检测结果具有良好的线性关系和可信度;用建立好的ddPCR方法对10份临床样品的高致病性PRRSV进行了拷贝数定量。 相似文献
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为了建立可绝对定量狂犬病病毒(RABV)的微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本试验根据RABV基因组起始区域设计引物和探针,继而优化引物和探针浓度以及退火温度,并对建立的ddPCR方法的灵敏度、特异性和重复性进行分析。结果显示：ddPCR方法的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃;ddPCR方法的标准曲线相关系数(R2)为0.999,呈现良好的线性关系;灵敏度高,最低可检测到3.37 copies/μL;特异性良好,与常见犬病原无交叉反应;重复性好,检测结果稳定。临床样品的检测结果显示,本试验建立的狂犬病病毒ddPCR方法与实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)方法的符合率为100%。结果表明,本试验建立的狂犬病病毒微滴式数字PCR方法灵敏度高、特异性强,可用于狂犬病病毒的绝对定量检测。 相似文献
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为建立一种鉴别诊断野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法,针对ASFV的B646L、EP402R、DP96R基因保守序列设计3套引物和探针,优化三重荧光定量PCR体系作为基础建立微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并对方法的特异性、灵敏性及重复性进行评估。结果显示,优化后的多重荧光定量PCR检测方法的标准曲线线性关系良好,对PRRSV、PEDV、PRV、VSV、PCV、RNase-free水、重组质粒标准品进行特异性检测,特异性良好;重复性试验结果显示,变异系数均小于2%;对3种重组质粒的最低检测下限均为102 copies/μL。参照上述多重荧光定量PCR方法优化后的条件,进行多重ddPCR检测方法的建立,并且对该方法进行评价。结果显示,ddPCR检测方法标准曲线的线性关系良好;特异性及重复性良好;最低检测下限B646L为11.6 copies/μL、EP402R为13.3 copies/μL、DP96R为16.9 copies/μL;ddPCR的检测灵... 相似文献
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5.
《中国预防兽医学报》2017,(7)
为建立蜜蜂幼虫芽孢杆菌(P.larvae)荧光定量PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中幼虫芽孢杆菌16S r RNA基因保守序列设计特异性引物和探针,经反应体系及条件优化,建立了检测P.larvae Taq Man荧光定量PCR方法。结果表明:该方法与其它病原无交叉反应;最低可检出1.3×10拷贝/μL的阳性质粒,比普通PCR灵敏度高100倍;重复试验显示该方法的批内和批间变异系数均小于3%。应用该方法对50份实验室模拟样品和100份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可用于美洲幼虫腐臭病(AFB)的早期快速检测及P.larvae定量分析。 相似文献
6.
《畜牧兽医学报》2017,(9)
为了建立伪狂犬病病毒(PRV)微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的检测方法,以伪狂犬病病毒gB基因为靶基因,建立了可对其准确定量的微滴数字PCR方法。对ddPCR反应中的引物浓度、探针浓度、退火温度进行了优化。对建立的ddPCR方法的特异性和敏感性也进行测定,并且应用于临床样品的检测。结果表明,ddPCR的最佳引物浓度为0.9μmol·L~(-1),探针浓度为0.25μmol·L~(-1),退火温度为60℃。ddPCR方法线性相关系数(R2)为0.998,显示呈良好的线性关系。检测限为6.1copies·μL~(-1),比荧光定量PCR(Real Time PCR,qPCR)的检测限低,变异系数为2.81%,与其他病毒无交叉反应。通过对临床样品的检测,与病毒分离比较,ddPCR方法的敏感性为87.5%,特异性为96.2%,符合率为97%。结果表明新建立的ddPCR方法,敏感性高、特异性强,可用于伪狂犬病病毒的定量检测。 相似文献
7.
为实现小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的快速、准确、定量检测,以国内PPRV Clone 9疫苗株N基因为靶位点设计特异性引物及探针,建立了液滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法,并对其特异性、敏感性及重复性进行评价。将所建立的ddPCR方法与实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,qPCR)方法的灵敏度进行比较分析并应用于PPRV(Clone 9株)核糖核酸标准物质的定量。结果显示,所建立的ddPCR方法特异性好,仅PPRV检测结果为阳性,其他羊源病毒类生物制品及毒种检测结果均为阴性;敏感性高,基因拷贝数检出限度为4.33拷贝/μL,比qPCR方法的灵敏度(57.3拷贝/μL)高10倍;重复性好,重复性试验的变异系数为1.8%;定量准确,具有一定资质的9家单位各组测量数据组间变异系数小于5%。试验建立的ddPCR方法能够有效地对PPRV核酸进行快速检测,为PPRV的诊断及绝对定量提供了有效方法。 相似文献
8.
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一种特异、灵敏、量化且耗时短的检测方法,通过设计1对PRRSV ORF7基因的引物,建立Eva Green染料的实时荧光定量PCR(real-time PCR)的检测方法,对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验,并检测PRRSV疑似感染的临床病料。结果显示,所建立的real-time PCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=0.999,具有良好的线性关系;与传染性胃肠炎病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)无交叉反应,特异性强;与常规RT-PCR检测方法相比,灵敏度提高100倍;重复试验表明变异系数系数在1%以下,重复性良好。对27份临床样品进行检测,结果比常规PCR多检出3份阳性。说明建立的real-time PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面均相比良好,可用于临床PRRSV的检测。 相似文献
9.
本研究旨在构建1种布鲁氏菌（Brucella）微滴式数字PCR方法（droplet digital PCR，ddPCR）。以布鲁氏菌BCSP31基因为靶基因，选取保守区域设计引物和探针，构建了布鲁氏菌微滴式数字PCR方法。然后优化了ddPCR反应中的引物、探针浓度及退火温度，并进行方法的灵敏度、特异性和重复性试验。结果表明，ddPCR的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol·L-1和250 nmol·L-1，最佳的退火温度为58℃。ddPCR的线性良好，最低检测下限为1.12 copies·μL-1，与大肠杆菌O：157菌株等其他4种细菌无交叉反应，而且批内重复性和批间重复性都较好。综上表明，本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强，可对布鲁氏菌感染的临床样品进行定量检测。 相似文献
10.
旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示：自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL-1,敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×101 copies·μL-1);模板浓度为1... 相似文献
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为建立牛的主要疫病的快速、准确及高通量鉴别诊断技术,以赤羽病病毒(AKV)、牛白血病病毒(BLV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)5种牛传染病病原为研究对象,将LAMP技术与微流控芯片技术有机结合,建立了相应的基因芯片检测技术,并优化了该基因芯片的反应条件。结果表明,建立的基因芯片可同时检测上述5种病原,特异性好,60 min反应时间即可给出检测结果。其中AKV和PPRV的敏感性为10~3 copies/μL,BLV的敏感性为10~5 copies/μL,BTV和BVDV的敏感性为10~2 copies/μL,与LAMP检测的敏感性一致。成功建立了基于LAMP技术的5重RT-LAMP基因芯片,可同时快速准确检测上述5种病毒,为口岸检疫探索出一种能快速、高通量检测动物疫病的方法。 相似文献
12.
为建立一种简单、快速、特异的口蹄疫病毒(FMDV)分子检测方法,本研究基于FMDV的3D基因,设计特异性引物和exo探针,建立了用于FMDV快速检测的等温实时荧光反转录重组酶聚合酶(Real-time RT-RPA)方法。该方法采用便携式等温扩增仪-Genie Ⅲ实时监测扩增结果,40℃20 min即可完成检测。结果显示,FMDV RT-RPA方法能够特异性扩增FMDV 3D基因,而对水泡性口炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、脑心肌炎病毒等均无扩增;以体外转录的FMDV 3D RNA作为模板,该方法在95%置信区间检出下限为1.0×10~2拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于1%;使用43份含有灭活FMDV的模拟临床样品分析显示,RT-RPA对FMDV的检出率为34.9%(15/43),略低于荧光定量RT-PCR的检出率(39.5%,17/43),而两种方法的符合率为95.3%(41/43)。RT-RPA能够在6 min～16 min内完成检测,而实时荧光RT-PCR则需要30 min～51 min。本研究所建立的实时荧光RT-RPA方法反应快速,特异性强,灵敏性高,操作简单,结合便携式具有荧光检测功能的等温扩增仪Genie Ⅲ,组建了FMDV快速检测平台,在基层兽医部门,尤其在野外及疫情现场的FMDV检测中具有极大的应用潜力,为设备仪器有限的实验室和田间对FMDV的快速检测提供了一种有效的方法,对于条件有限地区FMD的防控具有重要意义。 相似文献
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为了制备一种新型基因工程疫苗BTV-16 VLP疫苗,将蓝舌病病毒16型VP3与VP7基因片段插入杆状病毒双表达载体pFastBac Dual质粒中,通过转染Sf9细胞,同时表达VP3与VP7蛋白。经负染后电镜观察到有与蓝舌病病毒形态相似的核心样颗粒,表明蓝舌病VP3与VP7蛋白能自主组装形成核心样颗粒,并通过Western Blot试验验证该核心样颗粒与蓝舌病病毒具有相同的抗原性。因此本研究成功构建出16型蓝舌病病毒核心样颗粒,为病毒样颗粒装配打下了基础,为制备16血清型BTV VLP疫苗做好前期准备。 相似文献
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牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛疱疹病毒1型(BoHV-1)引起牛的一种接触性传染病,表现为上呼吸道感染及气管黏膜炎症、呼吸困难等症状,还可引起生殖道感染、脑膜炎、结膜炎、流产等多种病型。该病呈世界性流行,我国部分地区也有发生。BoHV-1感染造成的免疫抑制,容易使其他病原体侵入引发继发感染,从而导致牛呼吸道疾病综合征(BRDC)的发生,给世界养牛业造成了巨大经济损失。论文围绕IBR病原学、流行病学、诊断、防控等方面阐述了近年来牛传染性鼻气管炎的研究进展,以期为牛传染性鼻气管炎的诊断及防控提供参考。 相似文献
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沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌是食品中常见的致病菌,在国内外常引起食源性疾病。为解决食源性疾病中的微生物检测问题,本研究将免疫磁珠技术和ATP发光技术联合用于食品微生物检测,选择沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌病和金黄色葡萄球菌为检测对象,建立快速检测这3种常见食源性病原菌的富集及检测新方法。该方法在显著缩短预增菌时间的条件下,通过免疫磁珠的富集作用获得与常规增菌时间同样的效果,样品中的微生物浓度增加了10倍,大大提高了样本检出率,缩短了检测周期。结果表明,本研究建立的免疫磁珠富集后联合ATP发光技术具有快速、敏感、特异和低廉的优点,可用于检测食品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌以及金黄色葡萄球菌,具有较好的推广应用前景。 相似文献
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非洲猪瘟病毒p54抗原C端的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
利用大肠埃希菌表达非洲猪瘟病毒核心抗原p54蛋白C末端55个氨基酸的肽段(命名为p54-2),制备了多克隆抗体并进行了纯化,以进一步用于非洲猪瘟ELISA试剂盒的研发。将PCR扩增获得的p54-2目的片段与表达载体pGEX6p-1质粒均经过限制性内切BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建pGEX6p-1-ASFV-P54-2原核表达质粒。将该质粒转化到大肠埃希菌BL21中,诱导蛋白大量表达,并纯化获得高纯度的蛋白。将纯化的p54-2蛋白免疫小鼠,获得p54-2多克隆抗体并进一步纯化多抗。用ELISA、Westernblot对纯化的多克隆抗体进行效价滴定及特异性鉴定。结果显示,成功构建了pGEX6p-1-ASFV-P54-2重组质粒,在大肠埃希菌中IPTG诱导下,能够高效表达重组p54-2蛋白。用p54-2蛋白免疫Balb/c小鼠获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶128000,说明该蛋白有很好的免疫原性。Westernblot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别非洲猪瘟病毒p54胞内区,具有较高反应性和特异性,可以用于ELISA检测方法研究和p54抗原表位的鉴定。 相似文献
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通过制备脂多糖(LPS)并将其作为检测抗原,建立了一种检测奶样中布鲁氏菌抗体的酶联免疫层析方法。通过对处理方法和反应条件的优化,制备出敏感性高、特异性强的布鲁氏菌抗体检测试纸条。该试纸条敏感性为98.0%,抗体滴度为1:2~1:8,特异性为96.0%,且与其他常见病原无交叉反应,批内、批间重复性良好。保存期加速试验显示,该试纸条在2~30℃下可保存12个月;符合率验证显示,该方法与标准奶样的符合率达94.9%。上述结果表明,该检测方法具有敏感性高、特异性强以及方便、快捷等优点,适用于现场大批量检测,因而可应用于奶牛场布鲁氏菌病的快速诊断。 相似文献
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影响MALDI-TOF-MS微生物鉴定的因素有很多。本研究主要从微生物培养基、培养状态、菌体前处理、上样量等方面进行MALDI-TOF-MS操作技术和方法的探讨。研究结果显示:进行MALDI-TOF-MS细菌鉴定,培养时间在4～24 h之间为佳;尽量选择无色、不含盐的液体培养基;0.1μL菌液是最低鉴定菌量;上样量对结果无影响;对于菌体前处理,除按照标准化前处理程序操作外,也可将菌体加dd H2O制成混悬液进行点靶鉴定,这样更加简便。本研究有助于减少MALDI-TOF-MS操作盲目性,提高鉴定质量,利于操作的规范化和简便化。 相似文献
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为建立一种快速检测羊鞭虫病实时荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的羊鞭虫(Trichuris ovis)ITS基因序列(登录号:JF680987.1),设计特异性引物和TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,建立检测羊鞭虫病的TaqMan实时荧光PCR方法。对反应体系的特异性、敏感性和稳定性进行评价,并用该方法对临床样品进行检测。结果显示,该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R^2=0.994,扩增效率E=1.05。该方法特异性强,与其他8种常见家畜寄生性线虫病不发生交叉反应;灵敏度高,最低检出下限为31.7拷贝/μL;重复性好,组内和组间变异系数分别为0.43%~1.04%和1.20%~1.91%,均小于2.00%。用建立的实时荧光PCR方法和显微镜检查方法分别对20份临床样品进行检测,实时荧光PCR和显微镜检查方法检出的阳性样品分别为14和9份。本研究建立的TaqMan实时荧光PCR方法能在粪便中快速、准确、灵敏检测羊鞭虫卵,为羊鞭虫病的检测和防控提供新的方法。 相似文献