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以珙桐叶片为研究材料,用Rneasy Plant Mini Kit提取珙桐叶片组织总RNA,反转录成单链cDNA,长距离PCR方法合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K消化、SfiI酶切后,采用CHROMA SPIN-400柱分级分离,回收0.5 kb以上的cDNA组分,以λTriplEx2载体连接并进行体外包装,构建了珙桐叶全长cDNA文库.结果表明:以XL1-Blue、BM25.8为受体菌测定的原始文库滴度为8.3×106pfu/mL,扩增后文库总滴度为4.16×108pfu/mL,重组率为97.3%;对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定,表明插入片段大多分布在0.5~2.0 kb之间,文库质量较高.这为进一步开展珙桐EST测序分析、目的基因克隆及功能基因组学研究奠定了基础. 相似文献
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油茶种子EST文库构建及主要表达基因的分析 总被引：22，自引：6，他引：22
为研究油茶种子在油脂转化高峰期的基因表达并分离克隆与油脂合成等有关的重要基因,以油茶优良无性系湘林1号和湘林4号近成熟种子为材料构建cDNA文库;随机挑取2 327个克隆进行3'端测序构建EST文库.将数据完整并无X、N的1 979条cDNA序列与NCBI核酸数据库的非冗余序列进行同源性比较,确认763条cDNA序列与核酸数据库中其他物种的DNA序列具有很高或较高的同源性,可确认266种基因;有1 216个克隆序列为未知功能的基因序列.各类基因表现出不同的表达丰度,其中贮藏蛋白基因、与基因表达调控相关的基因、抗逆相关基因、种子成熟和胚胎发育相关的基因等为高丰度表达,与脂肪酸代谢相关的基因等为中丰度表达,另外还有大量的其他基因和未知功能基因在种子中表达.各类基因表达的数量和趋势与种子接近发育成熟阶段相吻合. 相似文献
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【目的】珙桐Davidia involucrata有性生殖能力弱是限制其自然更新的主要原因。为研究珙桐种子发育的分子机制,本课题组前期完成了珙桐种子转录组分析,筛选到1个编号为c37849.graph_c0的转录本,其在正常种子中高量表达,而在发育异常的种子中表达量很低,差异表达显著,因此将其作为研究目标。【方法】使用PCR克隆该转录本的全长序列,并利用在线分析工具对其编码氨基酸的序列特征、蛋白结构和系统进化等进行生物信息学分析预测,采用qRT-PCR检测目标基因在珙桐不同组织部位以及种子不同发育阶段中的表达情况。【结果】序列分析确定目标基因为一个编码CCCH型锌指蛋白转录因子的基因,将其命名为DiZF-CCCH1,该基因开放阅读框全长为711 bp,编码236个氨基酸,无内含子,相对分子量26.74 kDa,为不稳定蛋白,其氨基酸序列含有植物特有的RR-TZF结构域,与来源于甜橙Citrus sinensis的CCCH蛋白同源性最高。基因表达模式分析显示,DiZF-CCCH1在种子发育前期的表达量最高,后期表达量降低,在其他组织中仅有微量表达,推测其可能在种子发育过程中发挥重要作用。【结论】对珙桐DiZF-CCCH1基因进行了克隆与初步生物信息学分析,发现其编码的蛋白属于RR-TZF型锌指蛋白,且DiZF-CCCH1可能是珙桐种子发育过程中的重要调控基因,为进一步探索该基因在珙桐生殖发育过程中的功能奠定基础。 相似文献
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美洲黑杨雄性花芽cDNA克隆测序及表达序列标签(ESTs)特性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
采用SMART技术构建美洲黑杨雄性花芽cDNA文库.随机挑选4 200个克隆进行序列测定,获得原始序列3 092个ESTs,去除插入片段短于150 bp的序列和污染序列后,获得有效ESTs序列3 087个,平均长度515 bp.对聚类后的416个Clusters分别进行单独拼接,得到相应的Contigs和Singletons分别为451和1 104个,并通过与NCBI等核酸数据库进行比对、查询和注释,获得已知功能和未知功能的基因1 015个,无序列相似性的新基因540个.这些数据为进一步研究高等植物花发育提供了一个极有价值的资源. 相似文献
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油茶查尔酮合酶和异构酶基因的cDNA克隆 总被引：8，自引：6，他引：8
查尔酮合酶和查尔酮异构酶是类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为材料,通过分子克隆方法鉴定了1条查尔酮合酶基因全长cDNA和1条查尔酮异构酶全长cDNA.结果表明:油茶查尔酮合酶基因的cDNA含1479 bp,编码412个氨基酸,为目前最长的查尔酮合酶,与其它物种的查尔酮合酶具有极高的相似性,在进化上高度同源;油茶查尔酮异构酶基因的cDNA含899 bp,编码206个氨基酸,与茶的查尔酮异构酶基因高度同源,但与其它物种的相似性较低. 相似文献
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油茶ACP基因的全长cDNA克隆及序列分析 总被引：7，自引：2，他引：5
酰基载体蛋白是脂肪酸合成中的关键蛋白质,位于脂肪酸合成酶系的中央,作为脂酰基的载体将脂酰基从一个酶反应转移到另一个酶反应.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子生物学技术分离克隆了油茶酰基载体蛋白基因全长cDNA序列.结果表明：油茶酰基载体蛋白基因的全长cDNA为669bp,包含1个完整的CDS及3′UTR和5′UTR,编码141个氨基酸,该基因被命名为co-acp并提交至GeneBank,登录号是EU717697;油茶酰基载体蛋白基因的推导氨基酸序列与其它15种植物的ACP进行AlignX比较的结果表明,油茶酰基载体蛋白与油橄榄ACP的相似性最高,而且遗传距离最近;预测油茶酰基载体蛋白的二级结构以α螺旋为主,没有跨膜结构域和信号肽,其等电点约为4.995. 相似文献
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金桂芳樟醇合成酶基因的克隆与序列分析(英文) 总被引：1，自引：0，他引：1
以金桂的花器官为试材,设计芳樟醇合成酶基因简并引物,通过逆转录PCR、快速扩增cDNA末端技术和Blastn分析等,获得金桂芳樟醇合成酶基因的全长cDNA序列,命名为OfLis(Osmanthus frangrans vat.thunbergii linaiool synthase,GenBank登录号FJ645727).OfLis,基因全长cDNA长度为2 003 bp,包含1个1 731 bp的开放阅读框,编码576个氨基酸.序列分析表明:OFLis具有单萜烯类合成酶基因典型的保守结构域,即DDXXD和(N,D)D(L,I,V)X(S,T)XXXE;具有多数单萜烯类合成酶活性必需的RR(X)8W功能基团.OfLis推导氨基酸序列的预测分子质量和等电点分别为67.29 ku和5.26;疏水性分析结果表明其大部分氨基酸区域为亲水结构.氨基酸水平上,OfLis与薰衣草芳樟醇合成酶基因的相似性最高,为63.6%,与山字草芳樟醇合成酶基因的相似性最低,为19.0%.逆转录PCR结果表明:整个花期内OfLis基因在花瓣、雌蕊和雄蕊中均有表达,而在萼片和叶片中不表达.研究结果为香味植物的育种、品种改良及香味成分的调控提供理论基础. 相似文献
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以湘林1号和湘林4号油茶优良无性系近成熟种子为材料,采用裂解法和改良的CTAB法提取总RAN;用磁珠法分离得到纯化的mRNA;在反转录酶和其他酶的作用下合成一链cDNA和二链cDNA;经与质料载体重组和转化大肠杆菌,成功地构建了世界上第一个油茶种子cDNA文库.经检测,文库存容量达106,重组率为88.21%.测序结果表明:克隆片段长度一般都大于600 bp,说明构建的文库质量较高,能够满足ESTs文库构建及从文库中分离筛选重要基因等研究工作的需要,为进一步研究奠定了很好的物质和技术基础. 相似文献
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以油茶近成熟种子为材料,根据油茶EST文库中已知的脂氢过氧化物裂解酶EST序列,利用3’RACE与5’RACE技术,克隆到脂氢过氧化物裂解酶的全长cDNA序列。该基因全长1648bp,,包含一个1476bp开放阅读框长,编码491个氨基酸,5’与3’非编码分别为52bp、121bp。预测该蛋白相对分子量为54.7779KDa,等电点为6.77,是个叶绿体转运肽,N端包含有22个疏水氨基酸残基组成的序列,不仅具有转运肽富含的丝氨酸,还含有大量转运肽中很少存在的脯氨酸。多序列比对发现油茶脂氢过氧化物裂解酶核苷酸序列与茶的相似性达到96%,因此将该基因命名coHPL。 相似文献
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松材线虫取食和致病相关基因的鉴定是揭示松材线虫病致病机制的重要研究内容。以松材线虫混合虫体为测试方,线虫卵为驱动方,构建二者差减cDNA文库。文库测序结果经序列拼接、功能注释,共获得松材线虫虫体特异表达的有效EST序列354个,拼接后获得34个重叠群,其中15个重叠群获得明确的功能注释,其中MixC12、MixC25、MixC33分别与过氧化物酶、β-1,4内切葡聚糖酶、锌指家族蛋白有较高的同源性,这些基因被认为与植物线虫的取食和致病性密切相关。RT-PCR分析验证了所获得的差减cDNA的代表性。 相似文献
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杉木木材形成过程扩展蛋白基因的克隆与表达分析 总被引：2，自引：0，他引：2
扩展蛋白是一类细胞壁结合蛋白,在一定的pH值下无需任何激活蛋白就可诱导细胞壁的伸展。以杉木木材形成的特异表达基因文库中获得的扩展蛋白ESTs序列为基础,通过RLM-RACE技术成功克隆到3条全长扩展蛋白基因。其中ClEXPA1 cDNA全长1033 bp,包括247个氨基酸的开放阅读框(ORF)区;ClEXPA2cDNA全长1374bp,包括268个氨基酸的开放阅读框;ClEXLA1cDNA全长1023bp,包括272个氨基酸的开放阅读框。进化树重建结果表明:ClEXPA1和ClEXPA2属于α-expansin(EXPA);ClEXLA1属于γ-expansin(EXLA)。实时定量PCR显示:ClEXPA1和ClEXPA2具有较为相同的表达模式,在形成层区域表达最高,在针叶及茎尖中度表达,成熟木质部表达较低,而根和花粉中几乎不表达;ClEXLA1在形成层及针叶中均有较高的表达,在木质部及茎尖中度表达,花粉中表达较低,而根中几乎检测不到。该组扩展蛋白的成功克隆,将为系统研究扩展蛋白在木材形成过程中的表达、功能及调控机制提供基因资源。 相似文献
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To check for the presence of Em-like proteins in seeds of the leguminous tree Robinia pseudoacacia L. (black locust), a cDNA library constructed from mRNA isolated from developing seeds was screened using radiolabeled cDNA encoding the Em protein from Vigna radiata as a probe. Sequence analysis of the identified cDNA clones revealed two classes of Em proteins in Robinia. The nucleotide sequence data for each class have been submitted to Genbank/EMBL Data library and are available under the accession numbers U40820 and U40821. Northern blot analysis demonstrated that the Robinia Em proteins are translated from mRNAs of approximately 800 nucleotides, which are abundant in the seed but are not expressed in the bark. Southern blot analysis indicated that the Em proteins in Robinia are encoded by at least two genes. The Robinia Em proteins have a high degree of sequence homology with previously characterized Em-like proteins from both monocots and dicots. 相似文献