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1.
利用RT-PCR方法从猪肝细胞总RNA中扩增出编码猪α干扰素基因,根据大肠杆菌偏嗜性及活性位点改造基因并克隆至原核表达载体p ET21a,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定。重组蛋白以包涵体形式表达,经变-复性及纯化处理后,获得多种不同基因型的高纯度猪α干扰素。用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明经过基因改造的猪α干扰素(Po IFN-M6)具有更高抗病毒活性,约为2.97×108U/mg。本研究为猪α干扰素基因工程产品的研发及其在临床兽医的应用奠定基础。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2016,(3)
采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。 相似文献
3.
[目的] 克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15（interferon stimulating gene 15,ISG15）基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础。[方法] 提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞（baby hamster syrian kidney,BHK-21）;同时亚克隆到原核表达载体pET-28a（+）构建重组表达质粒pET-28a-ISG15,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩ISG15蛋白;重组蛋白经镍离子亲和层析法纯化并免疫小鼠,获得鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体,利用Western blotting和间接免疫荧光技术（IFA）检测其反应性。[结果] 成功克隆瑶山亚种树鼩ISG15基因,并构建了其真核和原核表达载体,真核表达载体在BHK-21细胞中能高效表达;原核表达载体在大肠杆菌中30 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h获得重组蛋白（分子质量22 ku）,蛋白以包涵体形式表达,经镍离子亲和层析法得到纯化。乳化后的重组蛋白免疫小鼠,获得抗瑶山亚种树鼩ISG15的多克隆抗体,经Western blotting检测,制备的鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体稀释度在1：8 000时仍能够与0.01 μg ISG15重组蛋白结合。IFA检测发现,多克隆抗体能与真核细胞过表达的蛋白反应,抗体反应性良好。[结论] 构建的原核表达载体在大肠杆菌中高效表达瑶山亚种树鼩ISG15蛋白,重组蛋白纯化复性后具有良好免疫原性,获得的多克隆抗体为进一步研究树鼩抗病毒感染免疫奠定了良好基础。 相似文献
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[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(2)
本研究利用人重组干扰素IFNα-2A刺激牛肾细胞(Mardin-Darby bovine kidney cells,MDBK),并提取细胞总RNA。RT-PCR扩增牛源干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG 15),将其克隆入p Cold-TF表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达后,获得约70 k Da可溶性ISG15重组蛋白。用试剂盒对重组蛋白ISG15进行纯化回收,经BCA法测定其蛋白浓度为1 mg/m L。用纯化的ISG15重组蛋白免疫ICR小鼠,制备多克隆抗体血清,用间接ELISA方法测定多抗血清效价为1:102 400。利用Western blot进一步鉴定ISG15多抗血清,结果发现其与纯化的ISG15重组蛋白能发生特异性反应,可用于后续研究。 相似文献
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7.
本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。 相似文献
8.
为在大肠杆菌表达系统中高效表达牛α-干扰素(bovine interferon-α,Bo IFN-α),将经密码子优化后的牛α-干扰素成熟蛋白基因合成并克隆到表达载体p Cold II中,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得可溶性的表达蛋白。对重组菌表达条件进行优化,结果显示在IPTG浓度为0.64 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为9 h的条件下,可溶性目的蛋白的表达量最高。重组蛋白经镍柱纯化后的纯度为99.2%,表达量为36 mg/L菌液。重组蛋白在MDBK细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1×106U/mg。 相似文献
9.
从鸡胚原代细胞CEF中扩增出鸡HMGB1基因,构建重组原核表达质粒p ET-28a-ch HMGB1,并将p ET-28a-ch HMGB1转入大肠杆菌BL21(DE3)中,于37℃进行诱导表达,经SDS-PAGE分析表明该重组蛋白可以在大肠杆菌中高效表达且以可溶性蛋白的形式存在。蛋白通过Ni-NAT纯化树脂亲和纯化,并作为免疫原制备鼠抗ch HMGB1多克隆抗体血清。该多克隆抗体同时具有ELISA、Western blot和IFA效价,且特异性识别禽源细胞内HMGB1蛋白。 相似文献
10.
采用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素（JL-GolFN—α）成熟肽编码序列,将IFN—α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX—IFN—α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）的感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白（GST—IFN—α）。SDS—PAGE、Western—blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN—α融合蛋白（rJL—GoIFN-α）的分子量大小约为43ku,表达量占菌体总蛋白的25％。重组吉林自鹅仅干扰素,经谷胱甘肽Sepbarose-4B亲和柱层析纯化后,经过透析复性,得到纯化的目的蛋白,含量可达0．25mg／mL。将复性蛋白免疫新西兰白兔3次,制备高滴度的鹅IFN—α抗血清。本实验表达和纯化了鹅的IFN—α,并制备了兔抗鹅的IFN—α抗血清,为下一阶段鹅α干扰素重组蛋白的应用奠定了基础。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2016,(10)
根据GenBank中公布的犬α-干扰素(CaIFN-α)基因核酸序列,去掉信号肽后设计并合成1对引物,引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。以提取的犬肝脏DNA为模板,利用PCR技术扩增CaIFN-α基因,并分别克隆至表达载体pBV220、pET-32a(His标签)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统。重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。纯化目的蛋白,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。试验结果表明,与pBV220载体连接的目的基因表达的蛋白活性较低,而与pET-32a(His标签)连接的目的基因表达的蛋白活性较高,达2.56×106 U/mL。通过分析不同载体对IFN-α的表达情况,为生产高活性的IFN奠定基础。 相似文献
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根据大肠杆菌密码子的偏好性,试验对GenBank中已经发表的鸭α-干扰素基因序列进行密码子优化,人工合成后构建原核表达质粒pET30a-DuIFNα-ELP;将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达制备DuIFNα-ELP;通过SDS-PAGE切胶方法得到纯化的DuIFNα-ELP;纯化产物免疫小鼠后收获血清,用Western blotting验证免疫血清的特异性,并用ELISA法检测其特异性抗体滴度。根据类弹性蛋白多肽(ELP)温度敏感的可逆相变特性,通过重复可逆相变循环(ITC),在高盐离子浓度和临界温度下纯化重组蛋白,并采用微量细胞病变抑制法在MDCK/VSV系统中检测重组蛋白的抗病毒活性。结果表明:合成的重组鸭α-干扰素基因能成功表达,重组蛋白DuIFNα-ELP约80 ku,免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价为1∶1000000。抗病毒试验检测重组DuIFNα-ELP的抗病毒活性为1.0×106U/mL,比活性为1.25×106U/mg。这一结果为研制广谱、安全、高效的基因工程鸭α-干扰素提供参考,也为检测体内外DuIFNα的表达奠定了基础。 相似文献
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SIgA是评价黏膜免疫的重要指标,分泌片(SC)是SIgA的特有成分,为了更方便的获得大量的SIgA的分泌片,本研究应用RT-PCR方法扩增出SC基因片段,将SC基因片段克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经酶切和测序验证获得pGEX-4T-1-SC重组质粒;将获得的pGEX-4T-1-SC转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达重组蛋白rSC.重组蛋白rSC经鉴定和纯化后,按常规免疫程序制备多克隆抗体;利用Western blot对抗重组蛋白rSC的多克隆抗体进行鉴定.结果显示,该抗体能特异性识别猪初乳中的SIgA免疫球蛋白,而与猪初乳中的IgG不发生反应.因此,抗SC重组蛋白的多克隆抗体可以作为抗SIgA免疫球蛋白的特异性抗体,为进一步建立SIgA的检测方法及黏膜免疫的研究奠定基础. 相似文献
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《中国兽医杂志》2016,(8)
根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。 相似文献
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干扰素(interferon,IFN)因具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节作用而备受关注。本研究根据GenBank上公布的猪IFN-δ核苷酸序列设计1对引物,通过PCR方法扩增出猪 IFN-δ基因,片段大小为513 bp,并将其克隆到原核表达载体上得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta BL21(DE3)受体菌,经SDS-PAGE电泳分析,结果表明,pET-30a-DsbA-IFN-δ表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约20 ku,且主要以包涵体形成存在,经Western blotting分析发现表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。 相似文献
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马γ-干扰素成熟蛋白基因在大肠埃希氏茵中表达及其多克隆抗体制备 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR从ConA刺激的马外周血单核细胞（PBMC）中扩增获得含信号肽的马γ-干扰素（Equine interferon-γ，EIFN-γ）基因，将其克隆至载体pCR2．1-TOPO中。通过PCR方法从重组质粒（pCR-EIFN-γ）中扩增马干扰素成熟蛋白（MatureEIFN-γ，mEIFN-γ）基因，并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）。重组子经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，将纯化后的表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。结果表明，mEIFN-γ基因全长为441b口，含一个开放阅读框，编码146个氨基酸的成熟蛋白；对其表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在，重组蛋白相对分子量约为18Ku，且具有免疫反应活性。mEIFN-γ基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下，采用Ni^＋亲和层析纯化方法均可获得高纯度的重组马γ-干扰素制备的多克隆抗体，为建立马γ-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。 相似文献
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为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N蛋白鼠源多克隆抗体并验证其中和活性,试验采用RT-PCR方法扩增了PRRSV的ORF7基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达重组N蛋白,纯化重组N蛋白制成弗氏佐剂抗原,采用皮下多点注射法免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,以血清中和试验和间接免疫荧光法验证其中和活性。结果表明:试验成功扩增了大小为390 bp的ORF7基因片段,经双酶切和序列测定,重组表达质粒pET-32a-N构建成功,重组N蛋白分子质量约为28.0 ku,制备的多克隆抗体效价较高,重组N蛋白多克隆抗体按照1∶2、1∶4和1∶8比例稀释时,荧光数量与不加多克隆抗体时比较无明显区别。说明在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达了PRRSV重组N蛋白,制备的鼠源多克隆抗体能够与重组N蛋白发生特异性反应,但没有抗PRRSV中和活性。 相似文献
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克隆猪热休克蛋白40 (heat shock protein 40,Hsp40)基因并构建其原核表达载体,以纯化的猪Hsp40蛋白为抗原免疫兔制备抗猪Hsp40多克隆抗体。参照GenBank收录的猪Hsp40全基因序列,设计1对特异性扩增其CDS区全序列的引物,利用RT-PCR方法扩增猪Hsp40基因;扩增产物经双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1-His,测序无误后转化Arctic Express (DE3) RP感受态高效表达宿主菌,优化其表达条件(时间、IPTG浓度、温度)后,将可溶性的猪Hsp40重组蛋白用His-Band Ni^+层析柱进行纯化,用纯化的His-Hsp40重组蛋白免疫兔以制备多克隆抗体。采用抗原亲和纯化法对制备的多抗进行纯化,并采用间接ELISA法检测抗体效价。利用Western blot检测重组蛋白的免疫原性和反应原性,以及抗体的特异性。结果显示,克隆得到的猪Hsp40基因片段长度为1 485 bp,表达出的可溶性His-Hsp40重组蛋白相对分子质量约为57 800,制备出的猪Hsp40蛋白多克隆抗体效价为1∶512 000,且该多抗能够特异性识别His-Hsp40重组蛋白和猪肺泡巨噬细胞中的Hsp40蛋白。结果表明,成功克隆了猪Hsp40基因,表达并纯化了猪Hsp40蛋白,制备的兔抗猪Hsp40蛋白多克隆抗体能够有效地应用于猪Hsp40蛋白抗原的检测。 相似文献
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马γ-干扰素成熟蛋白基因在大肠埃希氏菌中表达及其多克隆抗体制备 总被引：5，自引：0，他引：5
采用RT-PCR从ConA刺激的马外周血单核细胞(PBMC)中扩增获得含信号肽的马γ-干扰素(Equine interferon-γ,EIFN-γ)基因,将其克隆至载体pCR2.1-TOPO中。通过PCR方法从重组质粒(pCR-EIFN-γ)中扩增马干扰素成熟蛋白(Mature EIFN-γ,reEIFN-γ)基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a( )。重组子经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,将纯化后的表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。结果表明,mEIFN-γ基因全长为441bD,含一个开放阅读框,编码146个氨基酸的成熟蛋白;对其表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,重组蛋白相对分子量约为18Ku,且具有免疫反应活性。mEIFN-γ基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下,采用Ni~ 亲和层析纯化方法均可获得高纯度的重组马γ-干扰素制备的多克隆抗体,为建立马γ-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。 相似文献
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牛源致病性大肠杆菌floR基因的克隆、表达及其抗体的制备 总被引：2，自引：2，他引：0
将耐氟苯尼考大肠杆菌的floR基因部分基因片段插入pGEX-4T-2原核表达载体中,构建以BL21（DE3）Codon Plus为宿主菌的原核表达体系。通过优化诱导条件,确定了floR1基因能在pGEX/BL21（DE3）codon plus中高效表达,且表达的重组蛋白为包涵体形式。对包涵体进行溶解复性后,将复性融合蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-FloR1融合蛋白。并以GST-FloR1融合蛋白为抗原免疫小鼠,成功制备出抗GST-FloR1融合蛋白的抗体。抗体的制备为FloR蛋白定位及其对氟苯尼考药物泵出功能抑制的研究奠定了基础。 相似文献