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为建立检测禽流感病毒(AIV)且同时区分H3N2亚型AIV的方法,本研究根据H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT-PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518bp为AIV M基因、418bp为N2亚型AIV NA基因、271bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518bp、271bp和518bp、418bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对H3N2亚型AIV的检测下限为100pg,96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。 相似文献
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为建立检测禽流感病毒（AIV ）且同时区分 H3N2亚型AIV 的方法,本研究根据 H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M 基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT‐PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518 bp为AIV M 基因、418 bp为N2亚型AIV NA基因、271 bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518 bp、271 bp和518 bp、418 bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518 bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对 H3N2亚型AIV的检测下限为100 pg ;96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。 相似文献
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《中国兽医学报》2015,(10):1626-1630
根据GenBank中H6亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、N1亚型AIV的NA基因和所有亚型AIV的M基因序列,分别设计并筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,建立了H6N1亚型AIV三重RT-PCR检测方法。对该法进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果显示,所建立的方法对H6N1亚型AIV可特异性扩增出447(H6亚型AIV)、325(N1亚型AIV)和669bp(AIV)目的条带,对H6亚型AIV扩增出447、669bp目的条带,对N1亚型AIV扩增出325、669bp目的条带,对其他亚型AIV仅扩增出669bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带;该法对H6N1亚型AIV检测下限为0.1pg;305份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。本研究所建立的H6N1亚型AIV三重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可同时快速鉴别检测H6、N1亚型AIV和所有亚型AIV,为H6N1亚型AIV的检测提供1种简便、快速和有效的方法。 相似文献
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根据基因库中H10亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N8亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因序列,分别设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,建立了H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法。该法对含有H10和N8亚型AIV的模板可特异性扩增出267 bp(H10亚型AIV)、464 bp(N8亚型AIV)和693 bp(AIV)目的条带,对H10亚型AIV扩增出267、693 bp目的条带,对N8亚型AIV扩增出464、693 bp目的条带,对其他亚型AIV仅扩增出693 bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限为10~3拷贝/μL。120份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。研究建立的H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,为同时快速鉴别检测H10亚型和N8亚型AIV提供一种简便、快速和有效的方法。 相似文献
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禽流感病毒A/goose/China/24/96(H7N3)分离株NP基因片段的克隆及其序列同源性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本文首次以广东禽流感无致病力分离株A/goose/China/24/96（H7N3）核蛋白（NP）基因核酸为模板，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR）技术，扩增出了预计的830bp左右的片段。将此扩增产物在克隆进pEGM-4Z载体，采用限制性内切酶、地高辛标记探针和序列测定对该重组质粒进行了鉴定。测出的NP序列经 Blast2.0比较，与GenBank中收录的AIV其它病毒株NP基因相应片段的同源性在91%以上。 相似文献
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采用PCR技术从重组质粒pMel-NP扩增得到了禽流感病毒（AIV）A／GOOse／Guangdong／1／96（HSN1）株的核蛋白（NP）基因，将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。将提取的pVAX—NP阳性克隆转染Hela细胞，48h后经间接免疫荧光试验和Western—blotting检测，NP基因在Hela细胞中已成功瞬时表达。表达产物的分子质量约为57ku，它与H5N1亚型AIV多克隆抗血清有较好的免疫反应。 相似文献
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从GenBank下载禽流感病毒(Auian in fluenza virus,AIV)NP基因序列,通过比对选取NP基因中较为保守的片段,设计1对引物,通过RT-PCR方法扩增270 bp的目的片段,经测序确认目的片段序列正确后,用地高辛标记扩增产物制备探针.在BSL-3实验室,用AIV人工感染鸡胚成纤维细胞和SPF鸡后,制作细胞涂片和组织石蜡切片,然后在经前处理后的细胞涂片和石蜡切片上进行原位RT-PCR,再与地高辛标记的探针进行原位杂交,对细胞和组织中的AIV进行检测和定位.研究结果表明,本方法能检测出约1μg/L质粒的DNA,并能特异性地在细胞涂片和石蜡组织切片中检测和定位AIV,且成纤维细胞感染病毒8 h后即可检测到阳性信号,具有良好的特异性和较高的敏感性,为动物组织中AIV的检测定位和致病机理研究提供了敏感、特异和更为直观的方法. 相似文献
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11株新城疫病毒广西分离株NP基因的克隆和序列分析 总被引：4，自引：0，他引：4
根据基因库中新城疫病毒(NDV)的NP基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对广西在2000～2003年暴发新城疫的鸡群中分离的11株NDV毒株NP基因进行RT-PCR扩增和序列测定,拼接出11个NDV广西分离株的NP基因的全序列,10个NDV广西分离株的NP基因阅读框的核苷酸序列全长均为1470 bp,编码489个氨基酸,它们的NP基因核苷酸全序列及推导的氨基酸全序列与10个已发表的NDV参考株的NP基因全序列比较分析结果表明:核苷酸序列同源性为84.8%～98.2%,氨基酸同源性为89.8%～99.4%. 相似文献
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将本实验室分离保存、已经过PCR扩增、核酸测序鉴定的三种不同亚型禽流感病毒(AIVH5N1、H6N2、H9N2)分别接种鸡胚,收集尿囊液,分离提取AIV总RNA。参考H1￣H15亚型禽流感病毒的核蛋白(NP)基因序列以及H5、H6、H9亚型AIV血凝素(HA)基因序列,设计四对引物:NP1,NP2;H5P1,H5P2;H6P1,H6P2;H9P1,H9P2,混合为PCR扩增多重引物MP1,下游引物NP2、H5P2、H6P2,、H9P2混合为逆转录反应多重引物MP2。AIV总RNA在相同反应条件下经MP2逆转录,用MP1进行PCR扩增,AIVH5亚型材料得到205bp,563bp两条扩增带,AIVH6亚型材料得到205bp,233bp两条扩增带,AIVH9亚型材料得到205bp,690bp两条扩增带,都与实验设计相符合,阴性材料没有扩增带。该方法成功实现四对引物进行RT-PCR反应同时检测出AIV,准确诊断H5、H6、H9三种禽流感亚型,检测时间短,特异性强,能及时检测出AIV亚型。 相似文献
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Development of enzyme-linked immunosorbent assay with nucleoprotein as antigen for detection of antibodies to avian influenza virus 总被引：3，自引：0，他引：3
During the avian influenza outbreak of 2003-04 in Southeast Asia, two avian influenza viruses (AIV), one of H5N1 subtype and the other H9N2 subtype, were isolated and identified from local farms. The nudeoprotein (NP) gene of the H5N1 AI isolate was cloned, and the segment encoding amino acid 47-384, which covers its major antigenic domains, was subcloned and expressed in E. coli. Subsequently, the NP (47-384) expression product was purified and used as the diagnostic antigen to develop a NP-based type-specific indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting antibodies to AI from chicken sera. The ELISA is shown to be specific for AIV and does not cross-react with chicken sera that has antibodies to other avian viruses. The NP(47-384)-ELISA was compared with a hemagglutination inhibition test and a commercial AIV ELISA kit in evaluating 150 sera samples from experimentally AIV-infected or vaccinated specific-pathogen-free (SPF) chickens. Our NP(47-384)-ELISA was more sensitive than the two tests and showed an 82% agreement ratio with the HI test and an 80.67% agreement ratio with the commercial kit. The NP(47-384)-ELISA and the commercial AIV ELISA were used to evaluate 448 field sera samples from diseased chickens or vaccinated chickens during the 2003-04 AI outbreak in China. The two ELISA tests had a 95% agreement ratio. We conclude that the NP(47-384)-ELISA developed in our laboratory was specific and sensitive and it has great application potential in China's long-term prevention and control of AI. 相似文献
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为了研究H9N2亚型AIV A/Chicken/Guangdong/333/2008的全基因组序列变异情况,试验利用RT-PCR方法扩增出该病毒的8个基因序列,并应用DNAStar和MEGA4.0软件分析所得基因序列。结果表明:该病毒HA基因的第226位氨基酸由Q(Gln)变为了L(Leu),其NP基因与Viet Nam/1203/2004(H5N1)的NP基因同源率最高。说明该病毒已具备了感染哺乳动物的分子特征,并可能在遗传演化过程中突变为高致病性的禽流感病毒(AIV)。 相似文献
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H9N2亚型禽流感病毒原位杂交检测方法的建立 总被引：4，自引：1，他引：4
根据已知禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)核蛋白(NP)基因序列，选取其中保守区域设计出1时引物。以RT-PR方法扩增出543bp的NP基因片段，采用地高辛标记制备探针。MDCK细胞人工感染H9N2亚型禽流感病毒后，不同时间取样制备细胞涂片，进行原位杂交，研究了禽流感病毒时MDCK细胞的感染。探讨了原位杂交的条件及其应用于检测AIV感染的可行性。结果显示，感染24h后，原位杂交可检测出细胞内的病毒RNA，并且杂交信号的强度与感染时间的长短有关。研究表明。原位杂交检测禽流感病毒，不但能很好地表现病毒和细胞的位置关系,而且具有较好的特异性和灵敏性，为禽流感病毒的组织原位杂交检测奠定了实验基础。 相似文献
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禽流感病毒分离株 A/Chicken/Wangcheng/4/2001(H9N2)核蛋白基因(NP)的克隆和序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
用无特定病原体 (ＳＰＦ)鸡胚增殖禽流感鸡体分离株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｗａｎｇｃｈｅｎｇ／４／２００１(Ｈ９Ｎ２)(ＷＣ２００１),提取病毒总ＲＮＡ。根据已发表的Ａ型流感病毒株ＮＰ基因序列 ,设计一对引物 ,运用反转录 -聚合酶链反应(ＲＴ -ＰＣＲ)扩增该病毒分离株的ＮＰ基因 ,克隆后进行序列测定。序列分析表明 ,扩增的ＮＰ基因为相应的开放阅读框架。ＷＣ２００１株ＮＰ基因序列与数株Ａ型流感病毒ＮＰ序列进行比较 ,相互间同源性在８０%左右 ,其中与Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｙ２８０／９７(Ｈ９Ｎ２)有很高的同源性 ,而与人流感病毒株和猪流感病毒株差异较大 ,显示禽流感病毒特征。 相似文献
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本研究直接从浓缩的鸡胚尿囊液中提取Ｈ１４禽流感病毒的ＲＮＡ,并根据已发表的Ａ型流感病毒株的核苷酸序列,设计一对引物,采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术成功地扩增了ＡＩＶ的核蛋白（ＮＰ）基因,以ｐＵＣ１１９为载体,以大肠杆菌ＪＭ８３为受体菌,并通过限制性分析证实,成功地克隆了该ＮＰ基因 相似文献
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根据禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）和血凝素（HA）基因序列，设计1对用来鉴定A型AIV特异性引物（NP—F,NP—R）和2对用来鉴定AIV H5和H9不同亚型特异性引物（H5-F，H5-R；H9-F，H9-R），建立了多重RT—PCR快速检测方法。该方法能同时从一种病毒扩增出2条核酸带。分别为型（NP：330bp）和亚型（H5A：550bp，或H9A：490bp）。通过对105份样品进行检测。并与病毒分离及琼脂扩散（AGP）血清学方法作平行对比，两者之间符合率达100％；试验灵敏度为10^2ELD50。结果表明，建立的多重RT—PCR为检测H5、H9亚型AIV提供了一种快速、经济、易行的技术。 相似文献
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AIV NP基因在噬菌体表面的展示及间接ELISA方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
利用DNA重组技术,将禽流感病毒（AIV）核蛋白基因片段克隆重组于溶菌酶缺陷噬菌体T4-z1,获得重组噬菌体T4-z1-NP。经SDS-PAGE和Westernblot检测证实,AIV核蛋白成功地在T4噬菌体表面展示。以T4-z1-NP为抗原建立了检测禽流感抗体的酶联免疫吸附试验（T4-NP-ELISA）方法。其与琼脂免疫扩散试验（AGP）的相对灵敏度为100％,特异性为87．62％,T4-NP-ELISA的检测准确率为91．43％。T4-NP-ELISA可检测H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体,而IBD、IB、MD、ND、EDS的阳性血清检测结果则为阴性。敏感性试验证实,当阳性血清以1：640倍稀释时仍能检测到流感病毒抗体,说明该方法比较敏感。对192份血样的检测显示,T4-NP-ELISA与IDDEXXELISA符合率为96．8％。这表明T4-NP-ELISA可检测AIV抗体,也为检测与诊断AI提供了一种技术选择。 相似文献