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1.
为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）游离受体定量检测方法,本试验用表达猪唾液酸黏附素（Sn）游离受体的重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc感染PK-15细胞,以细胞培养上清纯化的Sn4D-Fc游离受体作为标准抗原,鼠抗猪Sn免疫血清为一抗,生物素标记兔抗猪Sn多克隆抗体为二抗,建立定量检测Sn4D-Fc游离受体的双抗体夹心ELISA方法;用rAd-Sn4D-Fc注射仔猪,定期采集血清进行游离受体检测。结果显示,纯化Sn4D-Fc标准抗原的纯度为94.3%,能被Sn免疫血清识别;一抗的最佳工作浓度为5 μg/mL蛋白,二抗的最佳稀释度为1：4 000,夹心ELISA检测标准抗原的灵敏度为0.4 ng/mL,对照抗原无交叉反应;夹心ELISA能从重组腺病毒注射猪血清中检测到Sn4D-Fc游离受体,最高表达量为6.54 ng/mL,持续时间为15 d。研究结果表明,建立的双抗体夹心ELISA可用于PRRSV游离受体的体内外定量检测。 相似文献
2.
为了验证构建的重组腺病毒rAd-SRCR59-Fc能否在猪体内有效表达游离受体及其能否抑制PRRSV感染,将重组腺病毒注射断奶仔猪,用夹心ELISA检测SRCR59-Fc表达情况;选择PRRSV易感仔猪肌肉注射重组腺病毒rAd-SRCR59-Fc(4×109 TCID50/头),5 d后与JXA1株PRRSV人工感染猪同居饲养,定期测定体温、观察临床症状,采集血样和粪样进行PRRSV定量检测,对病死猪进行病理剖检和主要器官病毒载量测定。结果显示,重组腺病毒接种猪能表达SRCR59-Fc游离受体蛋白,并持续15 d左右;与感染对照组相比,rAd-SRCR59-Fc注射组首次高热时间和临床症状均推迟3 d,第5天~第13天临床症状评分显著低于感染组(P<0.01),至试验结束(25 d)仅有1头猪死亡;肺脏无明显肉眼病变,仅见少量坏死灶,病理切片显示肺泡壁轻微增厚;第3天~第13天病毒血症水平显著低于感染组(P<0.01),第5~第13天粪排毒量低于感染组(P<0.05),器官病毒载量均显著低于感染组(P<0.01)。研究表明CD163游离受体的重组腺病毒能有效阻断PRRSV毒株感染,可以作为PRRS预防或治疗性疫苗进一步研究。 相似文献
3.
《中国兽医学报》2015,(7):1112-1118
采用新的试验方法制备出纯度较高的抗猪Sn的鼠纯化IgG,并证实此种抗体可以阻碍PRRSV感染PAM,为研究猪Sn各结构域的作用提供参考,为进一步研究PRRSV侵入宿主的作用机制奠定基础。本试验分8个片段克隆猪Sn胞外区功能结构域(第2~17结构域),并分别构建重组表达质粒,转化到BL21进行诱导表达。通过优化蛋白表达条件,制备其重组蛋白,将8种重组蛋白混匀后制成混合抗原(SnE)免疫小鼠以制备其多克隆抗体血清,用间接ELISA的方法检测高免血清的效价,分离并收集血清。采用硫酸铵盐析与DE-52离子交换层析相结合的方法提取并纯化血清,得到纯度较高的鼠抗猪SnE抗体。无菌灌冲猪肺脏收集原代PAM至24孔培养板中,培养6h后,用抗Sn150(第1结构域)、SnE和Sn150+SnE等抗原的鼠纯化IgG以及鼠阴性IgG和PBS分别处理PAM,1h后用200CID50PRRSV感染PAM,分别在感染24、48h后用已建立的PRRSV实时荧光定量PCR方法检测感染细胞的病毒拷贝数。结果显示,PRRSV感染24h和48h时后,鼠抗猪Sn150抗体组的PRRSV mRNA拷贝数与阴性IgG组相比较均差异较小(P0.05);而鼠抗猪SnE抗体和Sn150+SnE混合抗体组的PRRSV mRNA拷贝数均显著低于对应的阴性IgG组,且鼠抗猪SnE抗体组24h和48h时PRRSV mRNA拷贝数分别是阴性IgG组的0.75倍(P0.001)和0.74倍(P0.001),Sn150+SnE混合抗体组24h和48h时的PRRSV mRNA拷贝数分别是阴性IgG的0.83倍(P0.01)和0.76倍(P0.001)。结果表明,鼠抗猪SnE抗体和Sn150+SnE混合抗体封闭后PRRSV感染PAM的能力降低,且效果显著,提示PRRSV的吸附和内吞作用可能与pSn整个胞外区都有密切的关系。 相似文献
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5.
检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用 总被引：10，自引：0，他引：10
以猪伪狂犬病病毒（PrV）Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体，纯化的抗PrV IgG为检测抗体，建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为，单克隆抗体576株的包被浓度为12．2μg／mL，IgG的工作浓度为16．0μg／mL，对PrV的检测灵敏度达15．6ng（0．156μg／mL），与乙型脑炎病毒（JEV）、猪瘟病毒（HCV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）和猪流感病毒（SIV）等无交叉反应。批间和批内变异系数较小，分别为6．39％和4．1％。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测，肺和脑PrV抗原检出率最高，其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测，发现二者的符合率可达到77．4％，比PCR敏感。实验结果表明：双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可广泛应用于动物组织中PrV的检测。 相似文献
6.
为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT-PCR方法分别扩增出PRRSV VR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,成功构建重组质粒pET-32a-GP4、pET-32a-N和pET-32a-GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4-N融合蛋白,并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接ELISA的包被抗原,通过不断优化反应条件,最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接ELISA方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体,并与商品化试剂盒进行比较,结果显示,GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82.7%,N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87.2%,GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85.5%;因此,N蛋白是间接ELISA方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。 相似文献
7.
斑点免疫金渗滤法检测猪生殖与呼吸综合征抗体的研究 总被引：4，自引：0，他引：4
应用提纯的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原包被硝酸纤维素膜，然后用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)建立了检测PRRS抗体水平的斑点免疫金渗滤法(DIGFA)。该法通过胶体金标记SPA直接显色，阳性者出现红色斑点，整个试验过程仅需5min即可判断结果；与猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病阳性血清不发生交叉反应；纯化PRRSV抗原的最低检测量为0．0553mg／mL，即55．3ng／点。对200份猪血清用该法与ELISA同时进行PRRS抗体检测，两种方法的符合率达98％。 相似文献
8.
重组N蛋白抗原检测美洲型PRRSV抗体间接ELISA方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
利用表达纯化的PRRSV特异N蛋白抗原表位基因的重组融合蛋白作为抗原,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。研究结果表明重组N蛋白的最适包被浓度为4.5μg/mL,最适包被条件为37℃1 h加4℃过夜,待检血清稀释度为1:40,HRP-兔抗猪IgG(1:1000)37℃孵育30min。经重复性试验、交叉试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高,与武汉科前ELISA试剂盒的符合率达93.2%。用已建立的方法检测2007年以前临床血清样本983份,总阳性率为48.6%。 相似文献
9.
为了获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2-399重组蛋白,以及利用Nsp2-399蛋白建立PRRSV早期感染的ELISA检测方法,试验克隆、原核表达了PRRSV DY株(GenBank登录号为JN864948)Nsp2-399重组蛋白,同时利用该蛋白建立并优化了ELISA检测方法。结果表明:成功克隆表达了PRRSV Nsp2-399重组蛋白,并建立、优化了Nsp2-399 ELISA检测方法。优化后的Nsp2-399 ELISA的最佳抗原包被浓度为1μg/mL,血清最佳稀释度为1∶40,最佳封闭液为10%胎牛血清,酶标二抗的最佳工作稀释度为1∶4 000,最佳显色条件为37℃、15 min。猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒阳性血清样品用建立的Nsp2-399 ELISA方法进行检测,S/P值均小于0.21,ELISA方法特异性良好。用本试验建立的ELISA方法和IDEXX ELISA检测试剂盒分别检测血清样品125份,总符合率为94.40%。说明成功建立了Nsp2-399 ELISA抗体检测方法,可用于PRRSV的抗体检测。 相似文献
10.
《中国预防兽医学报》2016,(2)
为建立犬免疫球蛋白G(Ig G)的检测方法,本研究以兔抗犬Ig G Fc段多克隆抗体为包被抗体,过氧化酶标记的兔抗犬Ig G(全分子)多克隆抗体为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA定量检测方法,并采用Protein A方法从犬血清中纯化犬Ig G作为ELISA检测标准品。该检测方法与小鼠、兔、马、牛、鸡及羊常见动物血清均无交叉反应,特异性好;最低检测下限可以达到4.8 ng/m L,敏感性较高。以本研究建立的ELISA方法检测犬细小阳性血清和阴性血清,阳性血清Ig G含量明显高于阴性血清;检测转染犬源化抗体序列重组质粒的细胞培养液上清,重组质粒在96 h表达量达到峰值。本研究为进一步建立稳定表达犬源化抗体的细胞系提供了特异性的定量检测方法。 相似文献
11.
《中国预防兽医学报》2017,(12)
为建立快速定量检测猪圆环病毒2b型(PCV2b)抗原含量的方法,本研究采用重组抗PCV2b纳米抗体作为捕获抗体,鼠抗PCV2b单克隆抗体为检测抗体,建立了定量检测PCV2b的夹心ELISA方法。该方法不仅能够用于猪圆环疫苗中PCV2b抗原的检测,还可用于大肠杆菌或杆状病毒表达的PCV2b衣壳蛋白(Cap)亚单位疫苗的检测,且与其它猪病毒无交叉反应。该方法检测细胞培养PCV2b的线性范围是104.3TCID50/mL~105.5TCID50/mL,样品回收率为89.3%~105.6%,该方法批内、批间变异系数小于5%,重复性好。该方法与间接免疫荧光方法(IFA)检测相同样品时误差值小于10%,并且ELISA检测结果离散度更小。分别用两种方法定量PCV2b抗原,取相同抗原量免疫猪,其诱导产生的PCV2b抗体效价无显著差异。本研究构建的夹心ELISA方法在定量猪圆环疫苗中PCV2b抗原方面,与传统的IFA方法比较其显示了良好的符合性,并具有更好的重复性和更短的检测周期,是替代IFA方法用于PCV2b定量检测的更优选择。 相似文献
12.
为建立一种准确检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的方法,通过对PRRSV基因连续缺失片段dNsp2(87)进行诱导表达,重组pUC57-dNsp2蛋白,经镍柱纯化后,作为抗原包被微量反应板,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。经反应条件优化,确定抗原的最适包被浓度为40μg/mL,最适封闭液为5%脱脂奶粉,检测血清稀释度为1:40,酶标二抗的最适工作浓度为1:5 000,最佳显色时间为1 h,确定阴阳性临界值为0.35(OD450)。该方法均不与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清发生交叉反应,具有良好的特异性。与IDEXX PRRSV Kit进行重复性、敏感性、符合性试验,证明该方法具有较好的重复性、敏感性、符合性。结果表明,该方法可用于临床PRRSV抗体的检测。 相似文献
13.
为建立一种敏感、特异、快速的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV N蛋白,亲和层析纯化后作为包被抗原,通过对各反应条件优化选择,建立了PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法,并进行了交叉反应和重复性试验,以及同类成品试剂盒间的应用效果对比试验。最终确定了抗原包被最佳浓度为2 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,血清及酶标二抗孵育时间均为30 min,显色时间为10 min,检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒等5种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该ELISA检测方法批内和批间重复性的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒效果比较显示符合率为94.7%。本研究建立的间接ELISA方法将为猪群感染野毒PRRSV后的快速诊断及流行病学调查提供一种简便易行、快速高效的血清学抗体检测方法。 相似文献
14.
纯化2株针对水牛γ-干扰素的单克隆抗体,其中1株进行HRP标记作为检测抗体,另1株单抗作为捕获抗体,建立检测水牛γ-干扰素的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)。通过对封闭液、抗体稀释液等条件进行优化,经过方阵滴定试验确定捕获抗体的最佳浓度为625 ng/mL,检测抗体的工作效价为1∶100;所建立的DAS-ELISA方法检测灵敏度25 ng/mL,批内变异系数为0.52%～6.86%,批间变异系数为5.6%～7.07%。采集60头单次皮内注射结核菌素的水牛肝素钠抗凝全血,利用牛结核杆菌特异性抗原rHIS-CFP10/ESAT-6融合蛋白体外刺激外周血淋巴细胞释放IFN-γ,用所建立的夹心ELISA检测所有样本,与皮内变态反应试验比较,结果显示,自制夹心ELISA方法检测水牛结核病的敏感性为62%,特异性为87%,符合率为75%,表明可应用于水牛结核病的检测。 相似文献
15.
《畜牧与兽医》2017,(1):65-70
为检测弓形虫循环抗原,以实现弓形虫急性感染的早期诊断,本研究建立了基于ABC(avidin biotin-peroxidase complex)放大系统的双抗体夹心ELISA方法。通过制备弓形虫排泄分泌抗原(ESA)并免疫动物,经3种抗原的筛选以获得抗循环抗原(CAg)的单抗,以方阵滴定法确定最佳多抗包被浓度和单抗工作浓度,利用夹心法和ABC放大系统建立检测弓形虫循环抗原的夹心ABC-ELISA方法,用该方法对人工感染犬血清和其他阳性血清样本进行检测以确定该方法的检出时间和准确性,并应用于临床样品的检测。结果:获得了3株针对不同抗原表位的单克隆抗体,并对CAg有较高特异性。双抗体夹心ABC-ELISA反应条件:兔多抗包被浓度为3.7μg/mL,生物素标记3A5、3E5和10F5-3单抗在混合工作液中的浓度分别为0.1、0.13和0.12μg/mL。该ELISA方法对ESA最低检测限为11.9 ng/mL,并与隐孢子虫早期感染牛血清、血吸虫尾蚴早期感染牛血清、艾美耳球虫早期感染鸡血清、犬瘟热急性感染早期血清、犬细小病毒急性感染血清无交叉反应。用该ELISA方法检测人工感染的犬,于感染后2 d血清即显示阳性,该方法能明显区分标准阳性血清和阴性血清。用该方法检测68份猪临床血样(其中包括2份标准阳性血清),检测结果与Nest-PCR结果一致。表明该双抗体夹心ABC-ELISA方法特异性强、敏感性高,可用于弓形虫急性感染的早期或活动期的诊断。 相似文献
16.
为建立一种敏感、特异、快速、高通量的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV M蛋白,将纯化后的重组M蛋白作为包被抗原建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRRSV基因组M基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约435 bp的M基因片段,将目的片段亚克隆至pET32a(+)表达载体中,经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组M蛋白,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测结果表明具有良好的抗原性和特异性。以重组M纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)其他6种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与商品化ELISA试剂盒的符合率为95.3%。本研究建立的M-ELISA检测方法将为猪群免疫PRRS疫苗后抗体水平监测及PRRSV野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便易行、快速、高通量的血清学抗体检测方法。 相似文献
17.
《中国兽医学报》2020,(2):225-230
应用PCR技术扩增出伪狂犬病病毒(PRV)gB基因,并将克隆的目的片段连接到表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-B。以表达纯化的gB重组蛋白为抗原,制备单克隆抗体和兔源多克隆抗体,并以制备的抗体建立检测PRV抗原的双抗体夹心ELISA方法,同时对吉林省某地区猪群感染PRV的情况进行流行病学调查。结果显示,试验成功制备PRV gB蛋白单抗并建立其夹心ELISA检测方法。流行病学调查发现,PRV在吉林省某地区猪群的平均感染率为9.3%,且妊娠母猪阳性率高达11.7%,该结果为伪狂犬病的防治提供了理论依据。结果表明,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异、敏感、简便与快速等优点,可用于PRV抗原的快速检测,为今后该病的诊断和流行病学调查研究提供技术手段。 相似文献
18.
唾液酸黏附素(sialoadhesin,Sn)是猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的主要受体,研究该受体在PRRSV感染过程中的作用依赖于特异的抗体.为制备Sn的抗体,首先依据通过DNAstar软件分析的抗原指数,确定编码114个氨基酸的Sn抗原表位基因(Sn114),然后依据大肠杆菌偏爱的密码子对该基因进行密码子优化,并由人工合成该基因.将合成的基因克隆到pET-32a(+)质粒中构建成与硫氧还蛋白(Trx)和6×His融合的Sn114基因原核表达载体,将表达载体转化BL21(DE3)大肠杆菌,在IPTG的诱导下使其表达.利用Ni NTA琼脂糖分离纯化表达的Sn114融合蛋白,再用Sn114融合蛋白免疫家兔,通过ELISA方法检测免疫后家兔血清的抗体滴度,并通过Western blot和细胞结合试验检测抗体的特异性.结果表明,本试验构建的Sn114表达载体能够介导Sn114融合基因在大肠杆菌中进行高效表达,表达量为63 mg/L;用纯化后的Sn114蛋白免疫家兔,免疫后34 d抗体滴度为1∶10 240.抗体特异性检测结果表明,所制备的Sn抗体能与猪肺泡巨噬细胞的Sn抗原进行特异性免疫反应. 相似文献
19.
为快速准确诊断和检测羊附红细胞体病,及时采取防治措施,建立了检测羊附红细胞体抗原的双抗夹心ELISA诊断方法。选取规模化养殖场羊,镜检附红细胞体红细胞感染率> 90%,无菌采取血液,分离羊附红细胞体抗原,制备纯化兔抗羊附红细胞体抗体,应用辣根过氧化物酶标记抗体,进行双抗体夹心ELISA试验。试验结果表明,双抗体夹心ELISA方法的最佳工作条件为:抗体最佳包被量为82.91 μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶400,抗原最低检出量为7.81 μg/mL;而且与支原体、大肠杆菌、葡萄球菌以及牛、猪、兔附红细胞体均不出现交叉反应,表明该方法具有良好的特异性,可用于羊附红细胞体病的诊断和群体检测。 相似文献
20.
家蚕成品卵微粒子病McAb-ELISA检测方法的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用纯化的微孢子虫抗兔多抗包被,做为捕获抗原,加入检测样品,然后用辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体作为检测抗原,并对各步实验条件进行优化,建立检测家蚕微孢子虫的双抗体夹心ELISA检测方法.试验结果表明,多抗最适包被浓度为10 ng/mL,最适包被条件为4℃过夜,酶标二抗工作浓度为1:2000,待检样品和酶标二抗的反应时间分别为37℃ 1.5h和1h,底物37℃显色15min.此方法对纯化孢子的检测量为3.125×105spores/mL,对体外"添毒"蚕卵的检测量为5×106spores/mL. 相似文献